Translation Grundlagen der Zellulären Biochemie

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1 Translation Grundlagen der Zellulären Biochemie
Institut für biophysikalische Chemie Labor für Strukturanalyse Heike Pöpperl, PhD Grundlagen der Zellulären Biochemie Translation Vorlesung zum Modul BCB P07 im Bachelor-Studiengang Biochemie Hannover

2 Translation = Übersetzung
Informationsfluss: DNA  mRNA  Protein mRNA Transkription Translation Übersetzung der linearen Basensequenz der mRNA, gelesen als Triplettcode, in die ebenfalls lineare Aminosäuresequenz von Proteinen.

3 Translation: mRNA abhängige Proteinsynthese
Die Translation findet an den Ribosomen statt. Transfer RNAs (tRNAs) mit ihren Anticodons dienen als Adapter für die Übersetzung des Triplettcodes. Durch die Anticodon-Codon Interaktion, trägt die beladene tRNA die korrekte Aminosäure an das korrespondierende mRNA-Codon. Das Ribosom katalysiert die Verknüpfung der Aminosäure mit dem wachsenden Peptid. Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, eine Familie von aktivierenden Enzymen, fügen spezifische Aminosäuren mit den passenden tRNAs zusammen: beladene tRNAs.

4 Translation Ribosomen mRNA Bakterium Translationsfaktoren, GTP, ATP
Aminoacyl-tRNAs „beladene tRNAs“ Aminoacyl-tRNA-Synthetasen Aminosäuren, ATP Unterteilt in: Initiation Elongation Termination Eukaryotische Translation: Räumlichen Trennung von Transkription und Translation. Komplexe Initiation. Eukaryot Bakterium

5 Der genetische Code Der genetische Code besteht aus Tripletts von Nukleotiden (Codons). Weil es vier Nukleotide (A,C,G,U) gibt, existieren 64 mögliche Codons (43): 3 Stopcodons (Ende der Translation) 61 Codons für die 20 Aminosäuren, einschließlich Startcodon Der genetische Code ist redundant (degeneriert); es gibt mehr als ein Codon für bestimmte Aminosäuren. Ein einzelnes Codon spezifiziert nur eine einzige Aminosäure, dh der Code ist eindeutig. Der genetische Code ist (fast) universell.

6 Der genetische Code „Standardcode“
Unpolare Aminosäurereste (AS): orange, basische AS: blau, saure AS: rot, polare ungeladene AS: violett, Met: grün Auffallende Codonverteilung 3. Codonposition In 8 von 16 Möglichkeiten ist die Aminosäure nur durch die beiden ersten Positionen festgelegt. U/C kodieren immer für die gleiche Aminosäure; A/G fast immer. 2. Codonposition U spezifiziert AS mit unpolarem Rest . Triplett GAN (wobei N eine beliebiges Nukleotid ist) kodiert für saure AS. Fazit: Manche Mutationen, vor allem in der 3. Codonposition, verändern die Aminosäuresequenz nicht: „stumme Mutationen“. Andere Mutationen bewahren den Charakter der AS.

7 Übersetzung der Codonabfolge auf der mRNA in die Aminosäuresequenz der Proteine
Wie? Adapter-Hypothese, vorgeschlagen von Francis Cricks in einem Schreiben an den RNA Tie Club 1955: In der einfachsten Form gibt es 20 kleine Adaptermoleküle, einer pro Aminosäure, und 20 Enzyme, die jeweils eine Aminosäure mit ihrem zugehörigen Adapter verknüpfen. Der Adapter erkennt die Sequenzinformation der RNA durch Bildung von Wasserstoffbrücken. Einige Mitglieder des RNA Tie Clubs, 1955 Von links nach rechts: Francis Crick, Alexander Rich, Leslie Orgel und James Watson. Foto: Alexander Rich Polypeptid Adapter mRNA

8 Transfer RNA, tRNA Meilensteine
tRNAs sind die Adapter für die Übersetzung des genetischen Codes. Sie sind die Vermittler zwischen der Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz. Meilensteine Paul Zamecniks Labor und Ogata und Nohara 1957/58: Aminosäuren werden an kleine RNA Moleküle gebunden. Lösliche RNA (sRNA), später tRNA. Robert Hollys Labor, 1965: Sequenz von Hefe Alanyl-tRNA (tRNAAla). Möglichkeit einer Kleeblattstruktur. Labore von Alexander Rich, Sung-Hong Kim und Aaron Klug, 1974: Röntgenstrukturanalyse mit geeigneten Kristallen, Auflösung 2.5 A: Hefe tRNA Phe.. Dreidimensionale L-Form.

9 tRNA: Kleeblattstruktur
Zwischen 73 und 93 Nukleotide, viele modifizierte Basen. Darstellbar in einer Kleeblattstruktur mit vier gepaarten Bereichen (Stämmen) und drei Schleifen mit ungepaarten Basen. Akzeptorstamm mit ungepaartem CCA 3’-Ende (AS mit A verknüpft, CCA wird in vielen Fällen nicht codiert, sondern nachtäglich angehängt). Anticodonarm: (Arm = Stamm +Schleife) Anticodonschleife. D-Arm, enthält meist Dihydrouridine (D) in der Schleife. TyC-Arm (Schleife mit der Basenfolge Ribo-Thymin-Pseudouracil-Cytosin). Variabler Arm von drei bis 21 Nukleotiden. 5’ Ende ist phosphoryliert, das 5’ Nukleotid ist gepaart. 15 invariante Positionen, 8 semi-invariante (entweder (R) Purin oder Pyrimidin (Y)). * modifiziert

10 Ungewöhnliche Nukleoside der tRNA
Uridin-Derivate Adenosin-Derivate Base: Hypoxanthin

11 Hefe tRNAPhe: 3D-Struktur, L-förmige Struktur
Anticodon C13 G22 7mG46 Tripelbasenpaar

12 Codon-Anticodon-Wechselwirkung
CGG Anticodon GCC Codon der mRNA 5’ 3’ 1 2 3 Unpolare Aminosäurereste (AS): orange, basische AS: blau, saure AS: rot, polare ungeladene AS: violett, Met: grün 61 codierende Codons. Degenerierter Code, vor allem die 3. Codonposition betroffen. Nicht alle 61 Anticodons kommen in den tRNAs vor. Mensch: 506 tRNA-Gene mit 48 verschiedenen Anticodons. Manche tRNAs erkennen mehr als ein Codon. Betroffen ist die Wechselwirkung zwischen 3’-Codonposition/ 5’- Anticodonposition.

13 Codon-Anticodon-Wechselwirkung
Wobble-Hypothese von Francis Crick, 1966 Standardbasenpaarung (kanonische Basenpaarung) der ersten beiden Positionen des Codons mit dem Anticodon. Bei der 3’-Codonposition, bzw der 5’-Anticodonposition gibt es etwas Spielraum (“wobble”) bei der Position und Orientierung der glykosidischen Bindung, so dass bestimmte Nicht-Standardpaarungen strukturell zulässig sind. Erlaubte Wobble-Kombinationen ( )

14 Erlaubte Wobble-Kombinationen
Codon-Anticodon-Wechselwirkung Wobble-Hypothese von Francis Crick, 1966 Erlaubte Wobble-Kombinationen ( ) Unpolare Aminosäurereste (AS): orange, basische AS: blau, saure AS: rot, polare ungeladene AS: violett, Met: grün Konsequenzen für die 3. Codonposition G kann eindeutig erkannt werden. Die anderen Basen bilden degenerierte Codons. Es sind mindestens 31 Anticodons für 61 kodierende Codons nötig.

15 Abweichungen vom Standardcode
Unpolare Aminosäurereste (AS): orange, basische AS: blau, saure AS: rot, polare ungeladene AS: violett, Met: grün Abweichungen in Mitochondrien Abweichung im Zytoplasma Das UGA-Stoppcodon codiert in einem speziellen Kontext die 21. Aminosäure Selenocystein Sec

16 tRNAs sind bifunktional
AAA UUU Codon der mRNA Anticodon Phe Spezifische Aminosäure Akzeptorstamm Aminosäuren müssen für dieTranslation aktiviert werden Kovalente Bindung an das 3’OH der tRNA “Geladene tRNA” auch: Aminoacyl-tRNA

17 Die Aminoacyl-tRNA Synthetase Reaktion
Ziel der Reaktion ist die Aktivierung der Aminosäure durch Ausbildung einer Esterbindung mit der korrekten tRNA. Diese Bindung ist die treibende Kraft der Proteinsynthese. 3’-Ende des CCA Akzeptorstamms Aminosäure

18 tRNAAla + Ala Ala-tRNAAla
Es gibt mindestens 20 verschiedene Aminoacyl-tRNA Synthetasen, meist eine für isoakzeptierende tRNAs Nomenklatur? tRNAAla + Ala Ala-tRNAAla Enzym = Alanyl-tRNA-Synthetase

19 Aminoacyl-tRNA Synthetasen
Aminoacyl-tRNA Synthetasen bilden zwei heterogene, unverwandte Familien, trotz gemeinsamer Funktionen. Unterteilung in zwei Klassen (Klasse I und Klasse II), aufgrund konservierter Sequenzmotive. Vier verschiedene Quatärstrukturen: , 2, 4 und 22 Untereinheiten können in der Größe von 334 bis zu mehr als 1000 Aminosäuren variieren. Unterschied zwischen Klasse I und Klasse II: tRNA wird an entgegengesetzten Seiten des Aminoacyl-AMPs positioniert. Daher zwei unterschiedliche Produkte.

20 Aminosäuren sind reaktionsträge Moleküle !
R – C - C O - O NH3+ Negative Ladung ist delokalisiert Carbonyllücke schwer zugänglich R – C - C O NH3+ P = O O- Gemischtes Anhydrid sehr gute Fluchtgruppe R – C - C O NH3+ CH2 – CH3 Ester, gute Fluchtgruppe

21 Aminoacyl-tRNA Synthetase: zwei Reaktionsschritte
1) Aktivierung der Aminosäure durch Reaktion mit ATP Aminosäure + ATP Aminoacyl-AMP + PPi Enzymgebundenes Intermediat Säureanyhdrid 2) Transfer der aktivierten Aminosäure an die kognate tRNA Aminoacyl AMP + tRNA Aminoacyl-tRNA + AMP Beladene tRNA Esterbindung

22 Aminoacyl-tRNA Synthetase Reaktionsschritt 1
Enzym Enzym R – C - C O - O NH3+ AMP Säureanhydrid ATP R – C - C O - O NH3+ + PPi Alle Aminoacyl- tRNA Synthetasen führen diesen Schritt durch

23 Schritt 2 – abhängig vom Enzym
CCA Enzym R – C - C O - O NH3+ AMP Transfer der Aminosäure zum 3’OH der tRNA Klasse II Zuerst Transfer der Aminosäure zum 2’OH der tRNA, dann zum 3’OH Klasse I CC O-P-OCH2 O O- - OH Adenin R H NH3+ C 3‘ ‘ AMP

24 Genauigkeit der Aminoacyl-tRNA-Synthetasereaktion
Bei der Translation am Ribosom bestimmt nur die Codon/Anticodon-Interaktion den Einbau der Aminosäure. Die Beladung der tRNA mit der korrekten Aminosäure muss daher durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetase gewährleistet werden. Die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sind die eigentlichen “Übersetzer” des genetischen Codes. Daher: Eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase muss sowohl die isoakzeptierenden tRNAs, als auch die entsprechende Aminosäure erkennen können.

25 Erkennung der tRNA

26 Erkennung der Aminosäure
Unterscheidung zwischen strukturell ähnlichen AS ist in der Aktivierungsstelle nicht immer mit genügender Genauigkeit möglich. Daher haben manche Aminoacyl-tRNA-Synthetasen ein zweites funktionelles Zentrum: eine Korrekturlesestelle oder „editing domain“ oder „proofreading domain“ (doppelter Filter). Diese hydrolysiert „falsches“ Aminoacyl-AMP und/oder „falsche“ Aminoacyl-tRNA. Die erreichte Fehlerrate liegt bei ca 10-4. Jede Korrektur geschieht letztendlich unter ATP Verbrauch (benötigt zur Erzeugung von Aminoacyl-AMP).

27 Spezielle tRNAs: E.coli tRNAfMet
Peptidbindung Methionin N-Formylmethionin Determinanten der tRNAfMet Ungepaarte 3‘ Base: Formylierung Verhindert Bindung an Elongationsfaktor EF-Tu GC Paare im Akzeptorstamm: Positionierung an der P-Stelle N-Formylmethionin (fMet): Bessere Bindung an IF-2

28 Spezielle tRNAs: Initiator-tRNA iMet aus Hefe
Durch Mutagenese bestimmte Determinanten Kolitz und Lorsch, 2010; Febs Lett: Die Initiator tRNA ist die am höchsten konservierte tRNA in den 3 Domänen des Lebens. Sie hat eine identische Sequenz in allen Vertebraten. Bindung an eIF2 nicht eEF1A, da die Konzentration der tRNAiMet unabhängig reguliert wird. Wichtig für Bindung an eIF2 A1:U72 statt G1:C72 und Met A54 statt T54: schlechtere Bindung an eEF1A G:C Paare im Anticodon-Stamm: Konformation des Anticodons? Bindung an der P-Stelle, aber weniger wichtig als in Bakterien. A20 und andere: Interaktion zwischen D-Loop und T-Loop.

29 Spezielle tRNAs: tRNA für Selenocystein tRNASec Selenocystein ist die 21. proteinogene Aminosäure
Seryl-tRNA-Synthetase bildet Ser-tRNASec Enzymatische Umwandlung zu Selenocystein Sec-tRNASec Sec-tRNASec erkennt das UGA-Stoppcodon Ein spezieller Elongationsfaktor erkennt die Sec-tRNASec, und bringt sie zum Ribosom. Zusätzliche Strukturmerkmale (stem-loop) auf der mRNA sind nötig um ein Selenocystein-kodierendes Stoppcodon zu spezifizieren. Selenocystein ist bei physiologischen pH-Werten deprotoniert und wird deshalb in das katalytische Zentrum von zum Beispiel Peroxidasen und Deiodinasen eingebaut. Es kommt nur in wenigen Enzymen vor, meist einmal. NH3+ COO- CH CH2 -Se Selenocystein

30 Ribosomen Orte der mRNA-abhängigen Proteinsynthese
Eukaryoten: Zytoplasma oder glattes ER Ribosomen sind Riboproteinkomplexe, bei denen die rRNA ganz wesentlich zur Struktur und Funktion der Ribosomen beiträgt. Peptidyltransferase: Ribozym. Ribosomen binden mRNA (kleine UE) und bis zu drei tRNA Moleküle (A = Aminoacyl-, P = Peptidyl-, E = Exit-Bindungsstelle). Aminoacyl- und Peptidylreste werden dabei so im aktiven Zentrum orientiert, dass eine Verknüpfung stattfinden kann (große UE).

31 Bestandteile der Ribosomen
Bakterien Größe 70S - Massenanteil RNA 66% Protein 34% Kleine UE 30S 16S rRNA 21 Proteine Große UE 50S - 23S rRNA 5S rRNA 36 Proteine E.coli Eukaryoten Größe 80S - Massenanteil RNA 60% Protein 40% Kleine UE 40S 18S rRNA 33 Proteine Große UE 60S - 28S rRNA 5.8S rRNA 5 S rRNA 49 Proteine

32 2D und 3D Struktur der 16S rRNA
rRNA grau, Proteine bunt

33 2D und 3D Struktur der 23S und 5S rRNAs
rRNA grau, Proteine bunt rRNA

34 Strukturanalyse von Ribosomen
1955 George Palade: elektronenmikroskopische Aufnahmen von freien and ER-gebundenen Ribosomen. 1960er 1970er Elektronenmikroskopie (EM): 2D und 3D Strukturen. Immun-EM: Lokalisation von Proteinen. Ab Mitte der 90er Cryo-EM (Joachim Frank). Auflösung bis ca 8 Å. Röntgenstrukturanalyse von Kristallen, Anfänge in den 80ern, Ada Yonath . 2000 Peter Moore und Thomas Steitz, 50S UE; Venkatraman Ramakrishnan und Ada Yonath 30S UE, 2,4 bis 3 Å. 2001: Harry Noller ganzes Ribosom 5,5 Å, später verbessert auf 2,8 Å Nobelpreis in Chemie 2009: Venkatraman Ramakrishnan, Thomas Steitz und Ada Yonath "for studies of the structure and function of the ribosome".

35 Translation: Initiation
Bildung eines Initiationskomplexes aus Ribosom, mRNA und Start-tRNA, gebunden an das AUG-Startcodon an der P-Stelle. Initiationsfaktoren E. coli Initiationsfaktoren Eukaryoten IF-1 eIF1A IF-2 eIF1 IF-3 eIF2 eIF2B eIF3 eIF4A eIF4E eIF4F eIF4G eIF4B eIF4H eIF5 eIF5B E P A M AUG 5‘ 3‘

36 Initiation: E. coli 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ fM GTP IF-2 IF-3 fM GTP IF-2 IF-1 IF-1
AUG 5‘ 3‘ IF-2 GTP fM IF-3 IF-2 GTP fM AUG 5‘ 3‘ IF-1 IF-1 IF-3 Shine-Dalgarno-Sequenz

37 Initiation: E. coli IF-2 GDP Pi fM IF-2 GTP AUG 5‘ 3‘ IF-1 IF-3

38 Initiation: E. coli 5‘ 3‘ A P Pi fM GDP E IF-2 Shine-Dalgarno-Sequenz
AUG 5‘ 3‘ Shine-Dalgarno-Sequenz

39 Shine-Dalgarno-Sequenzen (E.coli)

40 Initiation: Eukaryoten
Initiationsfaktoren Eukaryoten eIF1A Scanning, Startcodonauswahl eIF1 Scanning, Startcodonauswahl eIF2 regulatorisches G-Protein, bindet Met-tRNAiMet eIF2B GEF für eIF2 (katalysiert GDP/GTP Austausch) eIF3 multimerer Komplex, Gerüstfunktion, verhindert die Anlagerung der 60S UE eIF4A Helikase eIF4E 5‘-Cap-Bindungsprotein eIF4G Gerüstprotein eIF4B stimuliert Helikaseaktivität von eIF4A eIF4H stimuliert Helikaseaktivität von eIF4A eIF5 GAP-Funktion; stimuliert GTP-Hydrolyse von eIF2 eIF5B regulatorisches G-Protein, Anlagerung der 60S UE

41 eIF4E 5‘-Cap-bindendes Protein
eIF4E mit gebundenem m7GDP (Cap-Analog)

42 Initiation: Eukaryoten
PABP 3‘AAAAAAA m7G GCCRCCAUGG 4E eIF4G 4A eIF4F eIF2 M GTP 1 eIF2 M GTP eIF3 1A 1 1A eIF3 43S Präinitiationskomplex (PIC)

43 Initiation: Eukaryoten
PABP 3‘AAAAAAA eIF2 M GTP 4E eIF4G 4A 5 eIF3 eIF-3 4B 1A m7G 1 GCCRCCAUGG 4H ATP ADP + Pi ATP ADP + Pi Scanning 5 eIF2 M GTP eIF3 eIF-3 1 1A

44 Initiation: Eukaryoten
M GTP 4E eIF4G 4A eIF3 eIF-3 5 eIF2 1 1A m7G AUG 4H 48S Präinitiationskomplex (eIF4 nicht gezeigt)

45 Initiation: Eukaryoten
P A Pi 3‘AAAAAAA M Pi GDP GTP PABP GDP GTP 4E eIF4G 4A eIF3 eIF-3 eIF5B 5 eIF2 1 1A m7G AUG eIF4F 80S Initiationskomplex GDP GTP eIF2 eIF5B

46 Initiation: Eukaryoten
P A 3‘AAAAAAA M PABP 4E eIF4G 4A m7G AUG eIF4F 80S Initiationskomplex eIF2B GDP GTP eIF2 eIF2B

47 Regulation der Initiation
Eine selektive Regulation bestimmter Transkripte kann durch spezielle RNA-Bindungsproteine erfolgen, die Sekundärstrukturen in den 5‘- oder 3‘- untranslatierten Bereichen dieser Transkripte erkennen. Beispiel: Regulation der Initiation der Translation des Eisenspeicherproteins Ferritin RNA-Strukturelement IRE (iron response element) bindet das IRP (iron response element binding protein) nur, wenn zu wenig Eisen vorhanden ist. Die Bindung des Proteins verhindert die Initiation der Translation. Hoher Eisenspiegel Hoher Eisenspiegel  keine Bindung  Translation  Fe-Speicherung Niedriger Eisenspiegel Niedriger Eisenspiegel  Bindung  keine Translation Fe-Freisetzung

48 Regulation der Initiation
Eine generelle Regulation der Initiation kann über Interaktion mit und/oder Modifizierung von Initiationsfaktoren erfolgen Inhibition der Translation unter „Stressbedingungen“ durch Phosphorylierung von eIF2 durch verschiedene Kinasen. „Stress“ Kinase Virusinfektion PKR, Double-stranded RNA-activated protein kinase Häm-Mangel HRI, Heme-regulated inhibitor, aktiviert durch Häm-Mangel ER-Stress PERK, PKR-like ER kinase, aktiviert durch ungefaltete Proteine Aminosäuremangel GCN2 in Hefe, aktiviert durch Mangel an Aminosäuren Phosphorylierung von eIF2 verhindert den GDP/GTP-Austausch und verringert die vorhandene eIF2B-Konzentration (GEF für eIF2) durch Blockierung der Dissoziation von eIF2B und eIF2.

49 Regulation der Initiation
ATP ADP PKR PERKHRI GCN2 eIF2 M GTP GTP wird nach Erkennung des Startcodons hydrolysiert (48S Präinitiationskomplex) eIF2 GDP P GDP eIF2 eIF2 GDP eIF2B GTP eIF2B GDP eIF2 eIF2 GDP P eIF2B eIF2-Phosphorylierung verhindert die Dissoziation von eIF2B/eIF2 und damit den GDP/GTP Austausch und damit die Initiation der Transkription eIF2-Phosphorylierung kann durch eine Phosphatase rückgängig gemacht werden

50 Regulation der Initiation
Bindung von eIF4E (Cap-bindendes Protein) durch E4-BPs verhindern die Bindung von eIF4E an eIF4G. eIF4G kann die Cap-Struktur nicht mehr erkennen und eine Initiation findet nicht statt. Die Interaktion der E4-BPs kann durch Phosphorylierung aufgehoben werden. Wachstumssignale stimulieren die E4-BP-Phosphorylierung und damit die Translation. m7G 4E eIF4G 4A E4-BP m7G 4E eIF4G 4A eIF4F m7G 4E eIF4G 4A eIF4F E4-BP P E4-BP

51 ….weiter für besonders Interessierte

52 Cap-unabhängige Initiation durch
IRES-Sequenzen (internal ribosome entry site) Der reguläre Initiationsmechanismus mit Bindung des 43S Präinitiationskomplexes am 5‘-Ende der mRNA (über eIF4F) und Suche des Startcodons durch Scanning kann durch IRES-Sequenzen umgangen werden. IRES sind Abschnitte auf RNAs, die komplexe Strukturen bilden können und eIFs bzw den 43S Präinitiationskomplex direkt binden können. Gut charakterisierte IRES-Elemente gibt es in RNA-Viren, sie kommen aber auch in einigen eukaryotischen mRNAs vor. Funktion von IRES-Sequenzen in Viren: Umgehen die Notwendigkeit einer 5‘-Cap Struktur, bzw zelluläre Regulationsmechanismen, die eIF4E betreffen. Erlauben Transkription von Proteinen in polycistronischen Transkripten. Erzeugen Unabhängigkeit von Initiationsfaktoren, die von Viren modifiziert werden können, um die zelluläre Translation auszuschalten, zB Abspaltung der C-terminalen eIF4G-Domäne, die eIF4E bindet (Cap-Bindung). Ermöglichen eventuell die Umgehung der Phosphorylierung von eIF2 durch PKR als Antwort der Zelle auf Virusinfektion. Es gibt verschiedene IRES-Sequenzen, die die Translation eines downstream ORFs in unterschiedlichem Maß unabhängig von eIFs machen.

53 IRES-Typen Jackson et al, 2010, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 10,

54 Dicistrovirus-IRES Sekundärstruktur des Taura Syndrom Virus (Dicistrovirus) IRES Initiation der Transkription eines Dicistrovirus IRES Initiation braucht keine eIFs und keine Initiator-tRNA. Nach Bindung der 60S UE fängt die Translation mitten in einem Elongationszyklus an Deforges et al, 2015, Biochimie 114, 48-52

55 Die Entschlüsselung des genetischen Codes
Marshall Nirenberg und Heinrich Matthaei, 1961 in PNAS: Poly(U) RNA ergibt poly(Phe) (Phenylalanin) Vorraussetzungen: Funktionsfähiger zellfreier E. coli Extrakt (in vitro Translationssystem). (DNAse behandelt, endogene mRNA nicht lange stabil), enthält tRNA, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Ribosomen, Translationsfaktoren, ATP, GTP. Radioaktiv markierte Aminosäuren, 20 verschiedene. Möglichkeit der RNA Synthese durch Polynukleotidphosphorylase (isoliert aus Azotobacter vinelandii von Marianne Grunberg-Manago und Severo Ochoda, 1955). Polynukleotidkinase braucht kein Template. (NMP)n + NDP (NMP)n+1 + Pi (UMP)n + UDP (UMP)n+1 + Pi Polynukleotidphosphorylase Polynukleotiphosphorylase

56 Die Entschlüsselung des genetischen Codes
Francis Crick, Leslie Barnett, Sydney Brenner und Richard Watts-Tobin 1961 in Nature Arbeiten ausgehend von einer mit einer Proflavin induzierten Mutante des Phagen T4. Proflavin ist ein Interkalator und erzeugt Insertionen oder Deletionen Phage mit FC0 Mutation im rIIB Cistron (angenommene Insertion von einem Nukleotid); kann E. coli B lysieren, (Plaques bilden), aber nicht E. coli K12(lambda). Suche nach spontanen Revertanten bei denen die Insertion durch eine Deletion in der Nähe aufgehoben wird. Doppelmutanten bilden Plaques bei beiden E. coli Stämmen. Trennung der beiden Mutationen durch Rekombination mit Wildtyp-Phagen und Selektion. Einfachmutanten lysieren nur E. coli B.

57 Suche nach Supressormutation:
Ausgangssituation: Wildtyp: THE BIG RED FOX ATE THE EGG FC0 (+ Mutation): THE XBI GRE DFO XAT ETH EEG G Suche nach Supressormutation: Doppelmutante: THE XBI GRE FOX ATE THE EGG -D Mutationen durch Rekombination mit Wildtyp-Phagen trennen: FC1 (- Mutation): THE BIG REF OXA TET HEE GG Suche nach Supressormutation der FC1 Mutation, wie oben. Nach mehreren Runden erhielten sie eine Reihe von Phagen mit einer Insertion (+ Mutation) oder einer Deletion (- Mutation). Kombination von drei + oder - Mutationen ergibt „Wildtyp“-Phänotyp Drei + Mutationen: THE XBI GXR EDX FOX ATE THE EGG Drei - Mutationen: THE IGE FOX ATE THE EGG -B-R-D Daraus folgt der genetische Code ist ein Dreiercode (oder ein Mehrfaches davon)

58 Die Entschlüsselung des genetischen Codes
Francis Crick, Leslie Barnett, Sydney Brenner und Richard Watts-Tobin postulierten 1961 in Nature: Drei Basen (weniger wahrscheinlich, ein Mehrfaches von Drei) codieren eine Aminosäure. Der Code ist nicht überlappend. Basensequenz wird von einem festen Startpunkt gelesen, keine Satzzeichen. Der Code ist degeneriert (eine Aminosäuren kann von mehreren Tripletts codiert werden). Zusammen mit den Ergebnissen von Nirenberg und Matthaeis folgt daher: Das Triplett UUU codiert Phe