Protein-Protein Bindungsstellen Lennart Heinzerling

Worum geht es in den nächsten 45 Minuten? Auffinden von Protein-Protein Komplexen aus einer großen Menge potentieller Komplexe z.B. für -Interaction Networks -funktionelle/räumliche Zuordnung neuer Proteine durch neue Erkenntnisse über Bindungsstellen Bisher Docking mit bekannten 3D Strukturen zum Auffinden von Komplexen. Nun: Proteinsequenzen  Proteinkomplexe Herausstellen, dass Sequenz-> Protein neue Möglichkeiten eröffnet, da 3D Strukturen selten vorhanden sind, gerade für hypothetische Proteine

Sequenz  Komplex? Kann man aus der Sequenz eines Proteins genug Informationen ziehen um Bindungsstellen und Komplexe zu finden? Wir werden sehen: ja!

Verschiedene Methoden, verschiedene Einsatzgebiete In Silicio two Hybrid Korrelierte Mutationen Strukturelle Konservierung Evtl schmackhafter – Anwendungsmöglichkeiten usw

Erste Methode Korrelierte Mutationen und Bindungsstellen

Zeigen korrelierte Mutationen Bindungsstellen auf? An Interaktionsstellen muss zwangsläufig Koevolution statt finden Sind korrelierte Mutationen eindeutig mit Bindungsstellen verknüpft? Methode kann zur Unterstützung des Dockings eingesetzt werden oder zur Voraussage der Bindungsstelle aus der Sequenz

Methode zum Auffinden korrelierter Mutationen Alignment der Sequenzen wird erstellt Korrelation wird für jede Position berechnet Die n am besten korrelierten Mutationen werden als Bindungsstellen – AS betrachtet Xd Wert: Maß für den Anteil korrelierter Reste bei kleinem Abstand. Je höher desto besser Methode des Alignments genauer anschauen Xd-Wert: Maß für das Verhältnis von konservierten zu nicht kons. Aminosäuren, die sich räumlich nahe sind Zum Alignment´/Kontakt Reste. Tatsächlich werden die n am besten korrelierten Reste als in Kontakt stehend vorhergesagt. Die Korrektheit dieser Vorhersage wird allein über die räumliche Nähe, nicht über evtl. bekannte Bindungsstellen bestimmt Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

Testmenge Die Methode wurde hauptsächlich an inter-domain Kontakten getestet Test der Methode an zwei großen Mengen von Docking-Lösungen Zum Zeitpunkt der Untersuchung stand keine ausreichende Menge von Komplexen zur Verfügung „Echte“ Komplex-Tests daher nur an Hämoglobin und Hsc70

Sind sich korreliert mutierte AS näher? Untersuchung der 21 zweidomänigen Proteine ergab eine klare Tendenz korrelierter Mutationen, sich räumlich nahe zu sein Dies deutet darauf hin, dass korrelierte Mutationen Bindungsstellen aufzeigen können Legende anfügen Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

Sind sich korrelierte AS unabhängig von Domänenstellung nahe? Untersuchung an der geöffneten (3cln) und geschlossenen(2bbm) Form von Calmodulin Eindeutig größere Nähe der korrelierten AS bei geschlossener Form Ergebnis unterstreicht die Signifikanz von korrelierten AS als Indikator für Bindungsstellen Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997) Protein ist ein Enzym, dass in der geschlossenen Form ein Peptid-Substrat umfängt Sollten sich korreelierte Mutationen unabhängig von der Stellung der Domänen zueinander nahe sein, würde dies die Signifikanz einer kM für Bindungsstellen mindern

Anwendung: Unterstützung des Dockings 7440 mögliche Docking – Lösungen wurden für Proteine 2c2c und 3est generiert Die optimale Lösung hat einen Xd-Wert, der unter den besten 5% liegt Andere Lösungen mit hohem Xd-Wert sind der optimalen Lösung nahe Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

Gute Resultate mit einem Hetero-Dimer? Bisher nur Tests an Kontakten zwischen Domänen Zum Zeitpunkt der Untersuchung gab es keine ausreichende Datenmenge von PP – Komplexen A1-b1 Monomere des Hämoglobin als Testproteine Mehrere Docking-Lösungen werden generiert Der Xd Wert der optimale Lösung liegt in der Menge der 6% größten Xd-Werte Im Graphen ist wieder die Tendenz abzulesen, dass ein hoher Xd – Wert immer auf eine gute Lösung(niedirger RMSD) hindeutet, selbst wenn die Lösung nicht die optimale ist Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

Bindungsstellenvorhersage aus der Sequenz allein? Test am zwei-Domänen-Protein Hsc70 Domäne Nt – Struktur bekannt, Domäne Ct Struktur unbekannt Ergebnisse deuten auf eine eindeutige Docking-Lösung hin, wurden jedoch nicht validiert Was sollen die Linien in der Grafik? Die Lösung zeigt auf, das nur AS auf einer(der Vorderseite) der Nt Domain korrelierte Mutationen aufweisen. Das heißt, dass die Lösung grundsätzlich plausibel ist Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

Zusammenfassung korrelierte Mutationen Korreliert mutierte Aminosäuren deuten auf Bindungsstellen hin Die Auswahl der optimalen Docking-Lösung wird durch die Methode vereinfacht Anwendbarkeit außerhalb dieser Hilfsfunktion nicht hinreichend validiert, Testreihen zu klein

Nächste Methode In Silicio two Hybrid

In Silicio Two Hybrid Methode zum Auffinden neuer Proteinkomplexe und ihrer Interaktionsstellen Benötigt werden nur Sequenzen, keine 3D Strukturen

iS2H: So funktioniert es A: Alignment zweier Protein 1 und 2 mit mindestens 11 homologen Proteinen a,b,c... B: Für alle Proteine: Konkatenation des Alignments. Danach Berechnung der Korrelation zwischen den Spalten C: Verteilung der Korrelationsstärken innerhalb der Proteinen(P11,P22) und zwischen Proteinen(P12). Eingeteilt in 10 Korrelationsklassen Wie war das mit der Normalisierung Pazos, Valencia, PROTEINS 47(2002)

iS2H: Anwendung auf Testmengen Tests an verschiedenen Mengen bekannter Proteinkomplexe lieferten positive Resultate Daher dürfte Anwendung auf 67.238 potentielle Paare in E.Coli neue Erkenntnisse bringen Andere Testmengen: 1. Domänen. 14 zwei-domänen Proteine, Berechnungen für 133 mögliche Paare 2. 53 Proteine mit 31 bekannten Interaktionen aus anderer Untersuchung. 244 Paare mögliche Paare untersuch, 8 decken sich mit vorheriger Untersuchung. Mehrere „vernünftige“ Lösungen gefunden 3. 195 Paare mit 15 vorhergesagten Interaktioenn aus Fusionsanalyse

iS2H gegen 67.238 mögliche E.Coli PP – Paare. Ergebnisse: Pazos, Valencia, PROTEINS 47(2002) Ergebnisse und Möglichkeiten von i2SH. Unter den Komplexen mit hohem Interaction Index waren viele bekannte Komplexe aber auch vernünftige neue Möglichkeiten wurden aufgezeit Interaction Index Scores für die Suche in 67.238 potentiellen E.Coli Protein Paaren Mögliche Interaktionen des hypothetischen Proteins YABK_ECOLI

iS2H Zusammenfassung Methode zum Auffinden neuer Proteinkomplexe und deren Bindungsstellen Tests deuten auf gute Anwendbarkeit als Indikator für Interaktionen hin. Ergebnisse müssen verifiziert werden Ergebnisse komplementär zu Untersuchungen von Genfusionen  Methoden ergänzen sich

Nächste Methode Strukturell konservierte Aminosäuren und Bindungsstellen

Strukturell konservierte AS und Bindungsstellen Betrachte bekannte Proteinoberflächen: Unterscheiden strukturell konservierte AS zwischen Oberfläche und Bindungsstellen? Ziel: Z.B. - Erleichterte Vorhersage von Protein- Protein Interaktionen - Erleichtertes Drug Design durch Erkennen der Bindungsstelle am Target oder Design der Bindungsstelle als Pharmakophor

Auf der Suche nach strukturell konservierten Resten Zu Grunde liegender Datensatz von 1629 Proteinen mit bekannter Schnittstelle aus der PDB wird in 10 Familien eingeteilt Einteilung erfolgt nach Ähnlichkeit der Sequenzen Danach Multiples Strukturelles Alignment innerhalb der Familien Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

Multiples Strukturelles Alignment - MUSTA Alignment der Koordinaten der C-alpha Atome Es werden Koordinaten als Ausgangspunkte gewählt, die einander nahe sind Rotation und Translationen werden berechnet und bewertet

Ergebnisse: An Bindungsstellen bevorzugte AS Trp weist hohen Konservierungsgrad an Bindungsstellen auf. Weniger Eindeutig: Methionin, Phenylalanin Grafik farbig modifizieren, Trp deutet stark auf eine Bindungsstelle hin Allgemein: Hydrophobe Reste dominieren Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

Warum Trp, Met, Phe? Trp ist besonders groß -> hydrophobe WW stark Trp formt mit Ala Vertiefungen in der Struktur Phe und Trp stabilisieren evtl. polare Bindungen und damit die Komplexe Methionin: Rolle unbekannt

Energetische Hot-Spots Die freie Bindungsenergie an Bindungsstellen ist nicht gleichverteilt. Es gibt Punkte hoher Bindungsenergie, die zumeist polar sind Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

Sind Hot-Spots konserviert? Zwischen den konservierten AS und den bekannten Hot-Spots besteht eine hohe Korrelation Unterstreicht wichtige Rolle der Hot-Spots und die Signifikanz der Anwesenheit strukturell konservierter Reste Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

Was, wenn nicht genügend Strukturen bekannt sind? Bisher: Strukturelles Alignment(MUSTA)identifikation struktureller Konservierungen Nur eine Struktur bekannt und mehrere homologe Sequenzen  hybrides Alignment: Zuordnung der Sequenzen auf die Struktur Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

Zusammenfassung: Strukturell konservierte Reste Durch Alignment werden strukturell konservierte Reste aufgedeckt Energetisch hochwertige Bindungsteile sind stark konserviert Bestimmte AS deuten auf Bindungsstelle hin

Gesamtzusammenfassung Aus Struktur, Konservierung und Sequenz lassen sich Informationen bzgl. Bindungsstellen ziehen Voraussage von Bindungsstellen ist auch ohne 3D Struktur möglich iS2H: Vielversprechend beim Auffinden neuer Proteinkomplexe Korrelierte Mutationen: Als Unterstützung des Dockings gut geeignet Strukturell konservierte Reste: Beim Drug Design oder zur Identifizierung der Bindungsstellen in einem Komplex