Chromatographie Physikalisch-chemische Trennmethoden, bei denen die Stofftrennung auf einer unterschied-lichen Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase beruhen.

Was ist Chromatographie? Trennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und darin durch eine stationäre Phase transportiert. Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen. Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede trennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.

Mechanismen der Trennung 1. Adsorptionsgleichgewicht (feste stationäre Phase, flüßige mobile Phase): z.B. HIC, Adsorptionschromatographie. 2. Verteilungsgleichgewicht (flüßige stationäre Phase, flüßige oder gasförmige mobile Phase): z.B. Verteilungschrom., RP, GLC 3. Ionenaustauschgleichgewicht (Ionentauscher als stationäre Phase, Elektrolyt als mobile Phase): z.B. Ionentauschchrom. 4. Gleichgewicht zwischen einer mobilen und einer stag- nierenden flüßigen Phase : z.B. Gelpermeation, SEC 5. Gleichgewicht zwischen einem immobilisierten Liganden und einer flüßigen mobilen Phase: z.B. Affinitätschromatog.

Verteilungskoeffizient Der Verteilungskoeffizient Kd beschreibt wie sich eine Substanz zwischen zwei (nicht mischbaren) Phasen verteilt. Kd = Konzentration in Phase A Konzentration in Phase B

Kapazitätsfaktor Der Kapazitätsfaktor beschreibt die effektive Verteilung. Er besagt welche Menge an Substanz sich in einer Phase befindet. Kx = Damit ist der Kapazitätsfaktor von der Menge der Phasen abhängig. z.B.: Kd=1 und stat. Phase : mob. Phase = 10 : 1 10 x mehr in A als in B Anzahl Mol in stationärer Phase Anzahl Mol in mobiler Phase

Die Trennung I S D C

Das Chromatogramm Lösungsmittel-Peak Detektor- Signal Basislinie Zeit Programmstart Basislinie Detektor- Signal Lösungsmittel-Peak Zeit

Der Peak k‘ = = tR - tM tM t‘R tM tR ... Retentionszeit t‘R ... Netto-Retentionszeit tM ... Totzeit w ... Basisbreite Kapazitätsfaktor k‘ = = tR2 tR1 tM Detektorsignal h wh w tR - tM tM t‘R tM tM tR1 tR2 Zeit

Relative Retention (Trennfaktor) Trennfaktor a ist ein Maß für die Selektivität des Systems a = a wird durch die Eigenschaften der mobilen und stationären Phase bestimmt. k‘ ist von der Säulenlänge und von der Geschwindig-keit der mobilen Phase unabhängig! Peaks werden nur getrennt wenn k1‘ und k2‘ unterschiedlich sind. k2‘ k1‘

Die Auflösung 2 (tRB - tRA) wA + wB Die Auflösung R zweier benachbarter Peaks A + B ist definiert als: R = 0.5 2 (tRB - tRA) wA + wB R = 0.8 R = R = 1.5

Trennstufenmodell tR w N = 16 . ( )2 Trennstufen (theoretische Böden) H = Höhenequivalent eines theor. Bodens (HETP) Zahl der theoretischen Trennstufen N gibt an, wie oft eine Gleichgewichtsein- stellung entlang der Säule erfolgen kann. Das Höhenequivalent gibt an, auf welcher Strecke (Länge) sich das Gleichgewicht einmal einstellen kann. L N

Beinflussung der Auflösung R = 0.25 . (a - 1) . N . ( ) 1 + k‘ k‘ Selektivität des Systems „Wechselwirkungen“ Leistungsfähigkeit der Trennsäule Stärke des Elutionsmittel

Verbesserung der Auflösung 1. Relative Retention (a) Änderung der station. Phase Wechselwirkungen der mob. 2. Trennstufenzahl (N) bessere oder längere Säule (2L1.4R); v von mobil. Phase 3. Kapazitätsfaktor (k‘) Stärke der mobilen Phase ändern N und k' bleiben gleich a a und k' bleiben gleich N N und a bleiben gleich k'

Quantifizierung Etablierung der Basislinie Messung der Peak-Flächen oder -Höhen Einfache Kalibration Gebrauch von Internen Standards

Die Basislinie Die Basislinie ist nicht (immer) eben!  „Drift“ der Basislinie  „Tailing“ oder „Fronting“  spät eluierende Peaks  schlecht getrennte Peaks  Säulenbluten

Peak-Fläche und Peak-Höhe Abschätzung der Peak-Fläche A über die Breite auf halber Höhe (wh = b0.5) A = wh . h Mit Integratoren oder Computerprogrammen errechenbar. Erkennung des Peak-Anfangs und -Endes wichtig.

Einfache Kalibration Für jede Substanz wird eine Kalibrationskurve erstellt. Kalibration sollte mindestens 4 Konzentrationen beinhalten und mit jeder neuen Charge an Proben neu erstellt werden!

Kalibration mit internem Standard Flächen-Quotient FQ1 = = = 1.05 FQ2 = = = 1.91 FQ3 = = = 2.81 PQ1 = = = 1,61 entspricht 1.64 Konz Fläche Std 1 1,05 Fläche IStd1 1,00 Fläche Std 1 1,62 Fläche IStd2 0,85 Fläche Std 1 2,98 Fläche IStd3 1,03 Fläche Probe 1,35 Fläche Istd P 0,84

Klassifikation der Chromatographie Planare Chromatographie: Dünnschichtchromatographie Papierchromatographie Säulenchromatogrphie: Flüssigchromatographie (LC, HPLC, IEC, GPC) Gaschromatographie (GLC, GSC)

HPLC & GC Methode Stationäre Phase Prinzip (A) HPLC LLC flüssig, adsorb. Feststoff Verteilung LSC Feststoff (z.B. Silikagel) Adsorption IEC Ionentauscher Ionenaustausch SEC Polymer mit Poren Molekülgröße (B) GC GLC flüssig, adsorb. Feststoff Verteilung GSC (a) Feststoff Adsorption (b) Molekularsieb Molekülgröße