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High-Level Acetaldehyde Production in Lactococcus lactis by Metabolic Engineering Roger S. Bongers, Marcel H. N. Hoefnagel and Michiel Kleerebezem Netherlands,

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1 High-Level Acetaldehyde Production in Lactococcus lactis by Metabolic Engineering Roger S. Bongers, Marcel H. N. Hoefnagel and Michiel Kleerebezem Netherlands, September 2004

2 Einführung Acetaldehyd: Wichtiger Aromastoff in Milchprodukten allgemein Wichtigster in Joghurt Joghurt Fermentation: Lactobacillus delbrueckii supsp. bulgaricus Streptococcus thermophilus Acetaldehyd kann hergestellt werden über: Aminosäuren Metabolismus Nucleotid Metabolismus Pyruvat Metabolismus

3 Einführung In Lactococcus Kohlenstoffmetabolismus: Pyruvat Pyruvat format lyase / Pyruvat dehydrogenase Acetyl- CoA Acetyl-CoA Aldehyd dehydrogenase Acetaldehyd Acetaldehyd wird kaum als Endprodukt der Fermentation hergestellt.

4 Einführung Gen-Transformation von Pyruvat decarboxylase (pdc) aus gram. neg. Zymomonas mobilis in L. lactis: Pyruvat pdc Acetaldehyd Acetaldehyd Alkoholdehydrogenase Ethanol Überexprimierung von endogener NADH-oxidase (nox) in L. lactis. NADH/NAD + Verhältnis ist tiefer. Laktat Produktion sinkt, wodurch die Pyruvat Verfügbarkeit steigt. Umwandlung von Acetaldehyd zu Ethanol sinkt.

5 Material und Methoden E. coli MC1061 als intermediärer Wirt für Plasmid Konstruktion. pdc aus Z. mobilis durch PCR vervielfacht. Klonung von pdc mit Promotor nisA in neues Plasmid (pNZ7300). nox aus L. lactis durch PCR vervielfacht. Klonung von nox mit Pomotor nisA in neues Plasmid (pNZ73001).

6 Material und Methoden nox aus Plasmid pNZ7301 wird erneut geklont, diesmal in das pdc enthaltene Plasmid pNZ7300. Es entsteht das Endplasmid pNZ7302, das sowohl pdc als auch nox enthält.

7 Material und Methoden pdc und nox Überexpression induziert durch Nisin: pdc Produktion verhält sich nicht linear zur Nisin Konzentration. nox Produktion verhält sich linear. Kombination beider Gene führt bei nox zu verminderter Produktion, während jene von pdc unverändert bleibt.

8 Material und Methoden 2-Schrit Fermentation Wachstum und Enzymproduktion. Metabolitenproduktion (Laktat, Acetat, Acetoin, Ethanol, Pyruvat, Acetaldehyd).

9 Resultate Aerob: Hauptprodukte von L. lactis NZ9000: Laktat Acetat Überexpression von nox: Laktat Produktion sinkt (Ldh = NADH abhängig) Acetoin Produktion steigt

10 Resultate Überexpression von pdc: ¼ der verbrauchten Glukose wird zu Acetaldehyd umgewandelt, wodurch die Laktat Produktion sinkt. Substrataffinitätkonstante (K m ) von pdc ist kleiner als jene von ldh. Kleine Menge Ethanol wird produziert.

11 Resultate Überexpression beider Gene: Laktat Produktion ähnlich wie bei nox alleine. Acetoin ist stark gesunken im Vergleich zu nox alleine. K m von als ist grösser als jene von pdc für Pyruvat Ethanol Produktion wird durch nox inhibiert.

12 Resultate Anaerob: Hauptsächlich Laktat Produktion Überexpression von nox: Metabolische Verschiebung von Laktat zu Acetoin und Acetat (ähnlich wie bei aeroben Bedingunen). (Ldh = NADH abhängig)

13 Resultate Überexpression von pdc: Hohe Acetaldehyd Produktion Hohes NADH/NAD + Verhältnis, weil kein nox. Relativ hohe Ethanol Produktion, weil adh Acetaldehyd zu Ethanol umwandelt.

14 Resultate Überexpression beider Gene: Glukose wird mit sehr hoher Effizienz zu Acetaldehyd konvertiert. Nox regeneriert NAD+ aus NADH, dadurch wird Pyruvat bevorzugt durch die NADH unabhängige pdc zu Acetaldehyd umgewandelt. Weniger Ethanol Weniger Laktat

15 Schlussfolgerung L. lactis erwies sich als geeigneter MO, um die Produktion von Acetaldehyd durch Überexpression von pdc und nox in einem industriellen 2-Schritt Fermentationsprozess (anaerobe Bedingungen) zu erhöhen. Sehr hohe Acetaldehydproduktion, evt. sogar zu hoch. Paper: Keine klare Unterteilung von Kapiteln. Ansonsten komplex, aber verständlich.

16 Fragen


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