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Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch.

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Präsentation zum Thema: "Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch."—  Präsentation transkript:

1 Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

2 Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien Ernten Aufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch Isolierung + Reinigung der Fraktionen Mitochondrien Mikrosomen Proteinbestimmung nach Lowry Markerenzymmessungen NADPH-Cytochrom c-Reduktase (Mikrosomen) Succinatdehydrogenase (Mitochondrien) Quantitative Bestimmung der Cytochromen Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

3 Puffer A (Dithiothreitol) Di-Sulfidbrücken werden dadurch aufgebrochen (Vorbereitung für Zymolyasezugabe) Puffer B ( Sorbit) & Puffer C ( Mannit) Damit der osmotische Druck stabil bleibt Zymolyase Enzym zum Abbau von Zellmembran Phenylmethylsulfonylfluorid Inhibiert proteolytische Abbaureaktionen Triton X-100 Detergenz löst Membranlipide Phenanzinmethosulfat Mediator zur Wasserstoffübertragung, verstärkt die Reaktion Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

4 Messung durch o Aktivitätsenzym, welches nur in spezifischen Organell einer Zelle eine Reaktion hervorruft o Immunologische Charakterisierung o Identifizierung von Zellfraktionen durch charakteristische Proteine mittels Elektrophorese o Elektronenmikroskopie, Bestimmte Strukturen und Dichte sind spezifisch für das jeweilige Organell. Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

5 Lactat Glucose Aerob Citratzyklus + Oxidative Phosphorylierung Mitochondrien Bis zu 12 ATP / Lactat Niedrigere Zellausbeute zu erwarten Anaerob, aber auch unter aeroben Bedingungen Glycolyse + Fermentation zur Energiegewinnung bevorzugt Cytosol 2 ATP / Glucose Pasteur-Effekt Crabtree-Effekt Höhere Zellausbeute zu erwarten Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

6 Lactat -> Pyruvat liefert keine Energie, deshalb erfolgt keine Fermentation sondern eine aerobe Verstoffwechselung durch den Citratzyklus Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

7 Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit Cytochrom b 2 Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

8 Lactat Glucose Atmungskette findet in den Mitochondrien statt- dadurch vermehrte Mitochondrien- Bildung Höherer Anteil an ß-1,6-Glucan (verursacht langsameren Verdau) in der Zellwand 50 min. bei 30°C mit Zymolyase Fermentation findet im Endoplasmatischen Reticulum statt- dadurch vermehrte Mikrosomen-Bildung Niedrigerer Anteil an ß-1,6- Glucan 30 min. bei 30°C mit halber Zymolyase-Menge Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

9 Ablesen der Proteinmenge in der Messküvette aus gegebener Kalibrationskurve (c[µg/2,6mL] gegen Absorption) Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

10 Benötigte Werte: Aktivität ([ΔE/min], entspricht der Steigung), in dem Bereich, in dem die Steigung maximal ist!- umrechnen in Minuten Volumen der Organellenfraktionen Proteinkonzentration in der jeweiligen Fraktion Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

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13 Mittels Lambert-beerschem Gesetz Wellenlängenpaar λ Basis /λ Max zur Bestimmung von ΔE Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

14 ε Proteinkonzent ration[mg/ml] E λmax,α E basis ΔEΔE c (Messlsg.) [mmol/l] c (Mit.-Susp.) [nmol/mg] Cytochrom aa3243,659 0, ,001150,01395,810E-040,1588 Cytochrom b25,53,694 0, , ,02871,125E-030,3044 Cytochrom c+c119,23,659 0, , ,07033,664E-031,0015

15 Verdünnungen beachten Einheiten Taschenrechner Schummelzettel Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

16 Fragen? Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch


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