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Methodenvergleich PCR- SSP/SSO Testsysteme SSP:BAG,Dynal,Olerup SSO:Elpha,Dynal Reli.

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Präsentation zum Thema: "Methodenvergleich PCR- SSP/SSO Testsysteme SSP:BAG,Dynal,Olerup SSO:Elpha,Dynal Reli."—  Präsentation transkript:

1 Methodenvergleich PCR- SSP/SSO Testsysteme SSP:BAG,Dynal,Olerup SSO:Elpha,Dynal Reli

2 Vergleich SSP-SSO SSP:Sequenz spezifische Primer SSO: Sequenz spezifische Oligonukleotide Elpha: Enzyme linked probe hybridization essay Reli:reverse line dot blot essay

3 Vergleich SSP-SSO n Überprüft auf : –Eindeutigkeit des Ergebnisses –Notwendigkeit von Wiederholungen –Auflösungsvermögen und detektierte Allele –methodische Probleme –Auswertung –Kosten und Materialverbrauch –Zeitaufwand

4 Vergleich SSP - SSO n SSP n Ergebnis nach Amplifikation n Zeitgewinn n SSO n Cyclerbedarf geringer n Probendurchsatz größer n DNA-Bedarf geringer n oft bereits im low- resolution-Set hohe Auflösung

5 Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

6 Prinzip der PCR-SSP 5´ 3´ 5´ Primerannealing bei °C Antisenseprimer Senseprimer

7 Prinzip der PCR-SSP 5´ 3´ 5´ Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet.

8 Prinzip des Dynal RELI SSO-Moleküle werden auf Membran immobilisiert Ziel-DNA wird mit biotinmarkierten Primern amplifiziert und dena- turiert auf die Membran gegeben Strepavidin- konjugiertes Reportermolekül macht Bindung sichtbar (enzymatisch..)

9 Erscheinung des Reli-Test

10 Prinzip des Elpha Capture Oligo- nukleotid ist an Wand des Reaktions- gefäßes fixiert PCR-amplifizierte biotinylierte DNA bindet an fixiertes SSO Streptavidin- reportermolekül ist mit Enzym gekoppelt, das Substratum- wandlung ver- mittelt Im letzten Schritt wird das Substrat, z.B. O-phenylene- diamin, als Farbreaktion umgesetzt

11 Erscheinung Elpha-Test

12 Vergleich SSP - SSO SSP Elpha Reli

13 Vergleich SSP-SSO n 27 Proben DRB und 26 Proben DQB in Vergleich n je 4 Homozygote in DRB und DQB n pro Probe DRB:BAG,Elpha,Reli DQB:Dynal/Olerup,Elpha, Reli n 1 x DQB-SSP allein, 2 x DQB SSP-Reli

14 Vergleich SSP-SSO n SSPElphaReli n Cycler47 Min 33,5 Min48,75 Min (reine Ampl.) n Detektion 18 Min110 Min100 Min (ohne Auswertung) n DNA12/30 µl4/2 µl4 µl (100 ng/ml) n DNA1:11:19/1:221:72 Verdünnung DQBDRB n Schritte21221 ohne Amplifikation

15 Vergleich SSP-SSO Kosten pro Test n SSPElphaReli n Kitpreis pro Bestimmung DRB37,-65,-45,- DQB15/1265,-42,- n Reagenzien dNTP-Puffer10,5 n Taq Polymerase0,86/0,360,36 inklusive n Restkosten Material, Fotographie, Zeit...1,506/12Pf6 Pf

16 Vergleich SSP-SSO Homozygotenerkennung n SSP ElphaReli DRB1/4 1/41/4 erkannt4,- nicht erkannt3,-;15,-;13,- n DQB3/4 2/44/4 erkannt6,-;2,- 6,-;2,-6,-;2,- nicht erkannt6,- 6,-;2,-

17 DRB-Allele der Sets

18 DQB-Allele der Sets

19 Reli-Auswerteprogramm

20 Elpha-Auswerteprogramm

21 Vergleich SSP-SSO Elpha-Frequenzentscheidung

22 Vergleich SSP-SSO Allelfrequenzen DQB (KM)

23 Vergleich SSP-SSO eindeutige Ergebnisse n SSPElphaReli h/va/vDR2 DR2 DRB 63%85%19%52% 41% 70% n SSPElphaReli allePrimerausfall DQB 93%77%75%100%

24 Vergleich SSP-SSO Auflösung n DRBSSP15,5% Elpha h/v82% a/v19,6% Reli48,3% n DQBSSP30% Elpha h/v77% a/v74% Reli71%

25 Vergleich SSP-SSO Wiederholungen n SSPElphaReli h/va/vDR2 DR2 DRB - insgesamt 37%15%81%41%59% 30% - Ausfälle 19%7%11% - Ag Ausschl. 22%7%44%26% - DR2 0%4%33% 30% n DQB - insgesamt 7%62%0% - Ag Ausschl. 7% - Ausfälle 0%15%

26 Vergleich SSP-SSO SSP-Problemfälle n DRB: BAG-Set kann bei Vorliegen von DRB1*13 *1424 nicht sicher ausschließen bei Vorliegen von *13,- kann auch *1130 nicht ausgeschlossen werden bei Vorliegen von *3,- kann auch *1420 nicht ausgeschlossen werden n Sets von Dynal oder Biotest zeigen dieses Problem nicht

27 Vergleich SSP-SSO SSP-Problemfälle n DQB in einem Fall einer DQB1*06 Homozygotie war ein *0304 nicht auszuschließen in einem Fall einer DQB1*0301 Homozygotie war eine *03032 und *0306 nicht sicher auszuschließen DQ 3 Splitaufteilung nur in DQ 7 möglich

28 Vergleich SSP-SSO Elpha-Problemfälle n DRB bei Vorliegen von DRB1*03/04 und *11/12 ist im Bewertungsmodus alle/vollständig auch *13 und *14 möglich zusätzlich sind bei Vorliegen von *03,*07,*11,*12,*08 ebenfalls *13 oder *14 möglich

29 Vergleich SSP-SSO Elpha-Problemfälle n DQB in Primermixen A oder B trotz positiver Kontrollbande kein spezifisches Amplifikat in 31% der Amplifikationen; in diesen Fällen nur bei 75% korrelierendes Ergebnis Wenn in jedem Mix spezifisches Amplifikat korrektes Ergebnis in 78% d.F.

30 Vergleich SSP-SSO spezieller Fall Elpha n DNA Probe SSP und Reli DQB1*02,- Elpha-Test: 1) alle Kontrollen positiv DQB1* 0301,0601 2) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 020x,030x 3) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 02,-

31 Vergleich SSP-SSO Reli-Problemfälle n DRB Bei Vorliegen von 3,- oder 13,- Homozygotie ist auch heterozygote 13,3 möglich Bei HLA-DRB1*11,12 kann *13 nicht ausgeschlossen werden Im Falle DRB1*03,11 wird homozy- got 3,- oder 11,- von der Auswerte- software als wahrscheinlich angegeben

32 Vergleich SSP-SSO Reli Problemfälle n DQB es steht keine Auswertesoftware zur Verfügung

33 Vergleich SSP-SSO spezieller Fall Reli n DNA Probe SSP-Ergebnis DRB1*03,11 Reli Auswertesoftware: 1) 0308,- 2) 1109,- 3) 03xx,0308 4) 03xx,11xx reproduzierbar

34 Bewertung Elpha-Test n Vorteile: –stabile DRB Amplifikation –automatisches Waschen –Gesamtprozeß- automatisierung verfügbar –Mit Update ist eine Auswertung auch früherer Daten hinsichtlich neuer Allele möglich –für DR2- Auftrennung werden Primer mitgeliefert n Nachteile: –instabile DQB Amplifikation –je nach Softwareeinstellung werden bestimmte Allele aus der Bewertung ausgeschlossen –sehr abhängig von technischer Ausstattung, die bei Defekt die Testdurchführung unmöglich macht –Pipettierarbeit zeit- und materialaufwendig –Dokumentation der Reaktion nur als Photometermeßwerte im PC und auf Ausdruck –viel Material nicht im Lieferumfang

35 Bewertung Reli-Test n Vorteile: –sehr stabile Amplifikationen –Testdurchführung mit wenig Materialaufwand –Streifen sind zur Dokumentation archivierbar –HLA-A und -B bereits verfügbar –kaum mechanische oder elektrische Geräte nötig n Nachteile: –für DQB keine Auswerte- software –keine Automatisierung der Waschschritte oder des gesamten Ablaufs verfügbar –schlechte optische Aufbereitung des Befundausdrucks

36 Bewertung SSP n Vorteile: –stabile Amplifikationen –Fotos des Gelbildes zur Dokumentation archivierbar –teilweise Automatisierung verfügbar n Nachteile: –hoher Platzbedarf im Thermocycler –ausgefallene Amplifikationen machen Neuansatz des gesamten Sets nötig –höhere Kosten für Polymerase –mehr Ethidiumbromid- gele als Sonderabfall –mehr Pipettieraufwand für einen Patienten


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