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Charakterisierung von Bakterienpopulationen auf Pflanzenwurzeln mit CLSM-Volumendaten K. Rodenacker, B. A. Hense, M. Rothballer IBÖ/ARB.

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Präsentation zum Thema: "Charakterisierung von Bakterienpopulationen auf Pflanzenwurzeln mit CLSM-Volumendaten K. Rodenacker, B. A. Hense, M. Rothballer IBÖ/ARB."—  Präsentation transkript:

1 Charakterisierung von Bakterienpopulationen auf Pflanzenwurzeln mit CLSM-Volumendaten K. Rodenacker, B. A. Hense, M. Rothballer IBÖ/ARB

2 © Rodenacker Inhalt Stichwörter Material Methoden Beobachtungen Zusammenfassung

3 © Rodenacker Stichwörter CLSM-Volumendaten Pflanzenwurzeln Bakterienpopulationen Charakterisierung

4 © Rodenacker Stichwörter CLSM-Volumendaten o -Stacks oAutomatische Erfassung Stackfolgen zeitlich/örtlich oAuflösung (pixel/voxel size): x,y:0,64 m z: 1,00 m

5 © Rodenacker Stichwörter Pflanzenwurzeln oKomplexer Aufbau (variabel über Zeit und Raum) oMultifunktionelles Organ oStrukturierte Oberfläche oInteraktionen mit anderen Organismen oAutofluoreszenz Bild aus: Ehlers/Noll: "Zellbiologie" (Serie Biologie), Westermann, Wien

6 © Rodenacker Stichwörter Bakterienpopulationen opathogene, PGPR (plant growth promoting) oEpiphyt/Endophyt (extra-/intrazellulär) oInteraktionen: Nährstoffe, pathogene Substanzen, Antibiotika u.a. oKommunikation 10 µm

7 © Rodenacker Stichwörter Charakterisierung oGröße, Intensität oAnzahl oLage oNachbarschaft räumliche Beziehung

8 © Rodenacker Material Bakterium: Azospirillum brasilense sp7 oEpiphyt oGFP-Markierung (induziert durch Wurzelexudate) Pflanze: Weizen oMonoxenisch oNährmedium Biologische Fragestellung Aufklärung der molekularen Kommunikation und Interaktion von Bakterien auf der Wurzel

9 © Rodenacker Material

10 © Rodenacker Methoden Qualitativ oVisualisierung Quantitativ oSegmentation oInteraktion oVermessung

11 © Rodenacker Methoden Qualitativ oVisualisierung (Anaglyph)

12 © Rodenacker Methoden Qualitativ oVisualisierung (orthogonale Schnitte) OriginalBearbeitetes Original

13 © Rodenacker Methoden Qualitativ oVisualisierung (virtual reality) Lokalisierung von Bakterien

14 © Rodenacker Methoden Quantitativ oSegmentation Wurzel Fermeture Radius 13*.64µm Schwelle: 5 -> Wurzelvolumen

15 © Rodenacker Methoden Quantitativ oSegmentation Bakterien in zwei verschiedenen Kanälen -> Bakterienvolumen -> Anzahl Cluster... Bakterien

16 © Rodenacker Methoden Quantitativ oVermessung Bakterien: Volumen Projizierte Fläche Fluoreszenzintensität Lage Ausdehnung in x, y und z oWurzeln: Volumen Fluoreszenzintensität

17 © Rodenacker Methoden Quantitativ (Anzahl Bakterien) oBestimmung der maximalen projizierten Fläche von isolierten Bakterien oBerechnung des mittleren Volumen -> Schätzung der Anzahl aus der Volumenverteilung -> Schätzung der Anzahl von Bakterienclustern

18 © Rodenacker Methoden Qualitativ oVisualisierung (Größen) interaktive Auswahl von Bakterien nach Größe

19 © Rodenacker Methoden Bakterien oAnzahlschätzung für zusammen- hängende Objekte aus der Volumenverteilung Vorgabe mittleres Volumen Residual Fitfunktion isoliert doppelt 3-fach

20 © Rodenacker Beobachtungen Wurzel oOberfläche oVolumen Bakterien oVolumen oProjizierte Fläche oIntensität oAnzahl

21 © Rodenacker Beobachtungen Wurzel Oberfläche/Volumen Wurzel 1Wurzel 2 Positionen10 Volumen eines Stacks40x512x51260x512x512pixel tot. Volumen42,9564, µm 3 tot. Fläche1,07 mm 2 geschätztes WurzelvolumenVwVw 33,1049, µm 3 geschätzte Wurzeloberfläche AwAw 1,001,03mm 2

22 © Rodenacker Beobachtungen Bakterien Volumen/Projizierte Fläche/Anzahlen Wurzel 1Wurzel 2 tot. BakterienvolumenV tB 21788, ,92µm 3 proj. Bakterienfläche6959,519933,62µm 2 Anzahl zhgd. Bakterien(cluster)nBnB maximale proj. Bakterienfläche1115pixel maximale proj. Bakterienfläche4,516,14µm 2 mittleres BakterienvolumenVBVB 6,1412,70µm 3 geschätzte BakterienanzahlV tB /V B aus Histogramm geschätzte Bakterienanzahl isoliert geschätzte Bakterienanzahl doppelt geschätzte Bakterienanzahl 3-fach geschätzte Bakterienanzahl 4-fach820 geschätzte Bakterienanzahl 5-fach180 Restvolumen5640,494734,60µm 3 Restanzahl918323

23 © Rodenacker Beobachtungen Bakterien Intensität/Auftreten Wurzel 1Wurzel 2 Ausdehnung Z-Richtung (MODE)45µm Fluoreszenz (MEAN)42,2482,41a.u. Bakterien/Wurzeloberfläche3536,382536,191/mm 2

24 © Rodenacker Zusammenfassung Probleme Durch das Erfassungssystem gegeben oSchwund der Fluoreszenz oVerlust durch nicht ideale Transparenz oSchwer zu standardisierende Einstellbedingungen Durch das Experiment gegeben oReproduzierbarkeit, Wurzelsphäre, Natur Stand oMakrogesteuerte Erfassung von Stack-Folgen o -Stacks für verbesserte Segmentation

25 © Rodenacker Zusammenfassung Zukunft oZunehmende Anzahl von unterschiedlich markierten Bakterien Info ohttp://rhizosphere.gsf.dehttp://rhizosphere.gsf.de Dank an oDavid Fanning oRobert Schäfer oKonrad Sandau


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