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S N A K E S N A K E Supraleitendes Nanoskop für angewandte kernphysikalische Experimente Mikroskopisch genaue Zellbestrahlung an S.N.A.K.E. V. Hable, A.

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1 S N A K E S N A K E Supraleitendes Nanoskop für angewandte kernphysikalische Experimente Mikroskopisch genaue Zellbestrahlung an S.N.A.K.E. V. Hable, A. Hauptner, G. Dollinger, R. Krücken, P. Reichart Physik-Department E12, Technische Universität München A.A. Friedl Strahlenbiologisches Institut, LMU-München G.A. Drexler Institut für Molekulare Strahlenbiologie, GSF T. Cremer, S. Dietzel Department Biologie II, LMU-München

2 S N A K E Gliederung Allgemeines Ziel Versuchsaufbau und -ablauf Biologische Experimente

3 S N A K ES N A K E Ziel

4 S N A K E Anforderungen Um Größenordnungen variierbarer Schaden

5 S N A K ES N A K E Einzelstrangbrüche (SSB) Doppelstrangbrüche (DSB) Die beiden wichtigsten DNA-Schäden

6 S N A K ES N A K E 55 MeV 12 C 296 keV/µm 17 DSB

7 S N A K E Anforderungen Breites Ionenspektrum (H, He, …, Au) am Münchner Tandembeschleuniger Um Größenordnungen variierbarer Schaden Auf Submikrometer fokussierte Einzelionen Einzelionenpräparation am Rasterionenmikroskop SNAKE

8 S N A K ES N A K E Einzelionenpräparation

9 S N A K ES N A K E

10 S N A K ES N A K E Testbestrahlung eines Kernspurdetektors Erzielte Auflösung

11 S N A K E

12 S N A K E Zellbehälter

13 S N A K E Bestrahlungseinrichtung

14 S N A K E Muster in Zellen Blau: DAPI-gefärbte Zellkerne Grün: FITC-gefärbtes Rad51, das nach Bestrahlung mit 100MeV 16 O zu den induzierten DSBs wandert

15 S N A K ES N A K E DNA-Reparatur durch homologe Rekombination

16 S N A K ES N A K E Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Rad51 Nach Trennung : DNA-Reparatur durch homologe Rekombination

17 S N A K ES N A K E Inkubationszeit, in der Reparaturmechanismen anlaufen Fixierung der Zellen und Zugabe primärer und angefärbter sekundärer Antikörper DAPI-Gegenfärbung der DNA Mikroskopie Aufbereitung der bestrahlten Proben

18 S N A K ES N A K E Fluoreszenzmikroskopie

19 S N A K E 3D-Mikroskopie Tiefenschärfe deutlich unter 1µm Der Zellkern kann in seiner Tiefe nicht mit einem Bild erfasst werden Aufnahme von Stacks in z-Richtung möglich γ - H2AX –H2AX: Histon, um das die DNA gewickelt ist –Phosphoriliert bei DSB –Evtl. Signalfunktion –Erscheint praktisch sofort nach Ionenbeschuss, daher sehr gut als Kontrolle geeignet

20 S N A K E Dekonvolution Unschärfe aus out of focus-Ebenen Das sichtbare Bild eines Objektes ist das Objekt gefaltet mit der PSF Verbesserung der Bildqualität durch Dekonvolution (= rechnerbasierte Entfaltung) oder konfokale Mikroskopie Fokusebene unterhalb des Punktes Ebene des Punktes PSF des Mikroskops Bild des Punktes z

21 S N A K E Dekonvolution

22 S N A K E Konfokale Laserscanningmikroskopie

23 S N A K E Konfokale Laserscanningmikroskopie Auffällig: Spuren am Rand des Kerns am ausgeprägtesten Echte Biologie?

24 S N A K E Interessante Reparaturproteine etc. Rad51 –Wichtiges Reparaturprotein bei der homologen Rekombination –Lebensnotwendig p53BP1 –Erscheint sehr früh (< ½ Std. nach Bestrahlung) –Leitet wahrscheinlich Reparaturprozesse ein ohne selbst daran beteiligt zu sein Mdc1 –Wie p53BP1 sehr früh und wahrscheinlich nicht aktiv an der Reparatur beteiligt –Leitet evtl. einen alternativen Reparaturweg ein γ - H2AX –H2AX: Histon, um das die DNA gewickelt ist –Phosphoriliert bei DSB –Evtl. Signalfunktion

25 S N A K E sch14_3 und sch20_3(Volker) blau = DAPI rot = H2AX grün = 53BP1 1 h nach Bestrahlung 6 h nach Bestrahlung 24 h nach Bestrahlung Rückgang durch abgeschlossene Reparatur? oder Vereinigung von Foci zu Groß- Komplexen? oder Durchgang durch Mitose? Zeitliche Dynamik der Foci Suche nach Korrelation zwischen chaotischen Mustern und Zellzyklus in der letzten Strahlzeit Versuch einer quantitativen Auswertung

26 S N A K E p53BP1 und Mdc1 p53BP1 –Erscheint sehr früh (< ½ Std. nach Bestrahlung) –Leitet wahrscheinlich Reparaturprozesse ein ohne selbst daran beteiligt zu sein Mdc1 –Wie p53BP1 sehr früh und wahrscheinlich nicht aktiv an der Reparatur beteiligt –Leitet evtl. einen alternativen Reparaturweg ein

27 S N A K E Zuerst: waagrechte Linien Untersuchung von Konkurrenzprozessen mittels Kreuzbestrahlungen Nach einer Zeit T: senkrechte Linien

28 S N A K E Kreuzbestrahlungen (T=0) -H2AX-foci (Cy3) 53BP1-foci (FITC) DAPI Vorbestrahlung ca. 10Gy, also ca. 350 DSB

29 S N A K E Kreuzbestrahlung (T=1,5h) -H2AX-foci (Cy3) 53BP1-foci (FITC) DAPI Fixierung jeweils nach ½ Std. Inkubationszeit

30 S N A K E Mögliche Ursachen Zellen tot bzw. so weit geschädigt, dass kein weiterer Reparaturversuch erfolgt Das in der Zelle vorhandene BP1 ist an den Reparaturpunkten der 1. Bestrahlung gebunden neue Strahlzeit mit Variation der Zeiten T, der Inkubationszeit und der Dosis der Erstbestrahlung sowie zusätzlicher Beobachtung von Mdc1

31 S N A K E Kreuzbestrahlungen April/Mai Leider Probleme mit den Antikörpern, insb. Mdc1 Bei längeren Zwischenzeiten T (>2h) keine Konkurrenz beobachtbar Effekt kann nicht auf Absterben der Zelle beruhen Bei längerer Inkubationszeit (>1h) keine Konkurrenz beobachtet

32 S N A K E Kreuzbestrahlungen April/Mai γ-H2AX (Cy3)p53BP1 (Cy5) (T=0h, Inkubation 1h)

33 S N A K E Kreuzbestrahlungen April/Mai (T=0h, Inkubation 1h, Niederdosisvorbestrahlung ca. 1,5Gy) γ-H2AX (Cy3) p53BP1 (Cy5)

34 S N A K E Kreuzbestrahlungen April/Mai Vermutung: Prozesse spielen sich auf kürzerer Zeitskala ab als angenommen Langfristiges Ziel: Lebendzellbeobachtung direkt am Bestrahlungsplatz

35 S N A K E Kreuzbestrahlungen April/Mai (T=0h, Inkubation 1h) DAPI γ-H2AX (Cy3)p53BP1 (Cy5)Mdc1 (Alexa488) alternativer Reparaturweg von Mdc1 konnte nicht verifiziert werden

36 S N A K ES N A K E Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns

37 S N A K E Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns Problem: Zellen danach schwer bis gar nicht zu finden Lösung: Bedruckte Zellfolie –Aluminisierte Mylarfolie wird belichtet und geätzt –Zweistellige Koordinaten im Abstand 300µm

38 S N A K E Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns

39 S N A K E Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns DAPI mit Fokus auf Folie DAPI mit Fokus auf Zellebene p53BP1 (Cy3) Merge

40 S N A K E Zusammenfassung und Ausblick Versuchsaufbau steht und liefert erste Ergebnisse Methoden zu sinnvoller quantitativer Auswertung müssen gefunden werden Untersuchung der Konkurrenzprozesse noch nicht abgeschlossen Mit perfektionierter Zielbestrahlung einzelner Kerne und Lebendzellmikroskopie existieren zwei Langzeitziele, die eine Vorreiterstellung in der Untersuchen der Dynamik von Reparaturvorgängen ausbauen würden


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