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- MicroRNA - Vorhersagen menschlicher Zielgene

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Präsentation zum Thema: "- MicroRNA - Vorhersagen menschlicher Zielgene"—  Präsentation transkript:

1 - MicroRNA - Vorhersagen menschlicher Zielgene
Präsentation von Sophia Bardehle Seminar Genomics, Juni 2005 betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ

2 Funktion von Zielgenen
Inhalt Bedeutung der miRNA „TargetScan“ Target - Vorhersagen Nachweis im Experiment Funktion von Zielgenen News - miRNA Targets Sophia Bardehle

3 Bedeutung der miRNA endogene, ~22-nt, nicht-codierende RNA
in Pflanzen und Tierzellen Funktionen:  molekulare Mechanismen unklar  bis 2003 miRNA Targets in Vertebraten unbekannt Zuerst in c.elegans erfporscht; auch in pfl. viel bekannt (vor allem entwicklungssteuernd) Funktionen: posttranskriptionale Restriktion (z.B. HOX) gene silencing mRNA Abbau (nur in Pflanzen) associated with a ribonuclease complex (RNA interference specif icity complex, or RISC) (http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_exp.html) - miRNA Targets Sophia Bardehle

4 = konservierte 5‘ Region
miRNA : Target 3‘ UTR Sequenz der mRNA nach Quelle 1) „miRNA seed“ = konservierte 5‘ Region Eine UTR zT mehrere Bindestellen für gleiche miRNA oder verschiedene miRNAs Bei Pflanzen bindet miRNA zT außerhalb 3‘ UTR MRE= miRNA recognition element keine perfekte W-C- Komplementarität - miRNA Targets Sophia Bardehle

5 „TargetScan“ Algorithmus zur Vorhersage von Zielgenen
für konservierte miRNA in Wirbeltieren Prinzip: Identifizierung der mRNA, die konservierte Bindung mit „miRNA seed“ eingeht. - miRNA Targets Sophia Bardehle

6 „TargetScan“- Methode
Grundlage: konservierte miRNA mehrerer Organismen (Rfam Download; Sanger Institute) Annotationen orthologer 3‘UTR mRNA-Sequenzen (Ensembl  EnsMart) - miRNA Targets Sophia Bardehle

7 „TargetScan“- Methode
Suche nach „seed-match“,d.h. perfekte W-C-Paarung einer Heptamersequenz zwischen 3‘ UTR und 5‘ „miRNA seed“ „RNAfold“ liefert optimale Basenpaarung für 3‘ Ende der miRNA nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

8 „TargetScan“- Methode
Berechnung der freien Energien G der miRNA : Target Interaktionen G1 G2 nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

9 „TargetScan“- Methode
4) jede UTR erhält Z-Score erwähnen, dass T= Gewichtungefaktor N ist Anzahl der miRNA Bindestellen nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

10 „TargetScan“- Methode
5) Sortierung der Z-Scores der UTRs  Rangfolge (Rank R) Untersuchung von Mensch, Maus, Ratte, Fugu Optimal: hoher Rang (großer Z) nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

11 „TargetScan“- Methode
6) Targetvorhersage Kriterien: - hoher Z-Score mit Z ≥ Zc - Rank R ≤ Schwellenwert Rc Parameter: Zc, Rc und T sind frei wählbar T = Gewichtungsfaktor für Affinität der Basenpaarung Erfahrungswerte: (Analyse von Maus, Ratte, Mensch) T= 20 Zc= 4,5 Rc= 200 - miRNA Targets Sophia Bardehle

12 „TargetScan“- Ergebnisse
Analyse von miRNA : Target Interaktionen 14.539 16.370 15.590 451 Limitierung auf konservierte, high-scoring > 400 verschiedene Zielgene nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

13 „TargetScan“- Ergebnisse
Ø 3,9 Targets pro miRNA (Klasse: Mammalia) signal noise („false positive“) signal:noise Verhältnis von 3.5 Kurze Erklärung: signal= Gesamtergebnis durch Targetscan noise= falsch positiv (miRNA Kontrolle(zufällig vertauschte Sequenzen mit <15% Abweichung zum Original) liefert Wahrheit; Test an UTR Bindung) nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

14 „TargetScan“- Ergebnisse
Bedeutung der Bindung an die 5‘ Region der miRNA nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

15 „TargetScan“- Probleme
unvollständige Annotationen für orthologe UTRs reale Targets fallen durch Z-Sore/Rank-Kriterium Bindestellen außerhalb 3‘ UTR unbeachtet nur konservierte Gene in Betracht gezogen gleichzeitige Interaktionen verschiedener miRNAs an einer UTR ausgeschlossen Fazit:  reale Anzahl an Zielgenen pro miRNA ist viel größer - miRNA Targets Sophia Bardehle

16 Experimenteller Nachweis
Methode - Luciferase Assay - Auswahl von 3‘ UTR menschlicher Zielgene  PCR Klonierung in Luciferase Vektor PCR  Selektion nach Insert: Wildtyp oder Mutante Transformation des Luciferase Reporter Plasmids in menschliche HeLa-Zellen Messung der Luciferase Aktivität (Lumineszenz) Photinus pyralis Luciferase katalysiert Oxidation von Luciferin (Leuchtstoff). Frei werdende Energie—> Biolumineszenz (grün-gelbliches Licht) Klonierung erfolgt downstream des Luciferase ORF; Durch PCR z.T. Punktmutationen in miRNA Bindestellen (Mutante) HeLa Zellen exprimieren endogene miRNA - miRNA Targets Sophia Bardehle

17 Experimenteller Nachweis
Luciferase Reporter Vector Selektion der Vektoren in Wildtyp und Mutante nach PCR nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

18 Experimenteller Nachweis
Interpretation Wildtype: miRNA : Target site Bindung  Luciferaseexpression ↓  geringe Lumineszenz Mutante: lückenhafte miRNA : Target Basenpaarung  Luciferaseexpression ↑  hohe Signale Luciferase Da Luciferase upstream des eingebauten UTR Fragments liegt, wird durch Bindung einer miRNA auch deren Expression unterdrückt. - miRNA Targets Sophia Bardehle

19 Experimenteller Nachweis
Luciferaseaktivität Blau: WT (Normalisierung mittels Renillaaktivität (Lumineszenz)) Rot: Mutante reporter Bewertung: Vgl.mit Expression bekannter Targets aus c.elegans (lin41/let 7 miRNA) >2,1 SMAD-1: DPP Family FUNCTION: Transcriptional modulator activated by BMP (bone morphogenetic proteins) type 1 receptor kinase. SMAD1 is a receptor-regulated SMAD (R-SMAD). (uniProt) N-MYC- protooncogen; nuclearer TF HOX-A5: Musterbildung FUNCTION: Sequence-specific transcription factor which is part of a developmental regulatory system that provides cells with specific positional identities on the anterior-posterior axis. Also binds to its own promoter. Binds specifically to the motif 5'-CYYNATTA[TG]Y-3'. nach Quelle 1) - miRNA Targets Sophia Bardehle

20 Experimenteller Nachweis
Ergebnis: 15 vermutliche Zielgene („TargetScan“) getestet 11 Gene experimentell bestätigt ca. 30 % der Vorhersagen sind „false positive“ - miRNA Targets Sophia Bardehle

21 Funktionen von Zielgenen
große funktionelle Diversität Beispiele TF: High-mobility-Proteine Signaltransduktion: STAT3 Rezeptor: LDL-R Strukturproteine: Collagen Enzyme: G6PD Translationsregulator:COP9 > 400 Zielgene konserviert zwischen Maus, Ratte Mensch COP9: Component of the COP9 signalosome complex (CSN), a complex involved in various cellular and developmental processes. The CSN complex is an essential regulator of the ubiquitin (Ubl) conjugation pathway (uniprot) G6PD: pentose pathway (nucleinsäure synthese) - miRNA Targets Sophia Bardehle

22 Funktion von Zielgenen
GO ID Biological Process miRNAs all orthologous genes no assignment/unknown 130 (32%) 5737 (40%) known biological process 270 (68%) 8802 (60%) GO: development 52 (13%) 1192 (8%) GO: protein metabolism 60 (15%) 1788 (12%) GO: cell growth and/or maintenance 92 (23%) 2742 (19%) GO: transport 44 (11%) 1442 (10%) GO: cell proliferation 23 (6%) (5%) GO: cell communication 76 (19%) 2704 (19%) GO: signal transduction 61 (15%) 2217 (15%) GO: phosphorus metabolism 30 (8%) (4%) GO: response to external stimulus 28 (7%) (7%) GO: regulation of transcription 82 (21%) (8%) GO: transcription 84 (21%) (9%) Großer Unterschied in biolog. Funktion zu pflanzl. miRNA: 69% TF; fast alle TFs steuern Pfl.entwicklung ( Säuger: nur 13%) Achtung: miRNAs steuern mehrere Gene (mit unterschiedl. Funktionen), d.h. können in mehereren GO Einträgen zugeordnet sein keine Aussage aus Summe der Prozentangabe# Letzete spalte: initial set of orthologous genes homo-mouse-rat - miRNA Targets Sophia Bardehle

23 News TargetScanS 2005 5-Genome-Analyse (signal:noise ↑)
 Identifizierung von 5300 meschlichen Genen, die durch miRNA reguliert werden (~30% des Genoms) TargetScan Webserver Datenbank zur Suche nach konserv. miRNA Targets bzw. Zielgenen TSS: homo, maus,rn, dog, huhn 6nt match flankierende Adenosine (5‘ an UTR) „S“ = Simplify - miRNA Targets Sophia Bardehle

24 Cambridge, Massachusetts Cambridge, Massachusetts
Referenzen Burge Lab MIT Departm. of Biology Cambridge, Massachusetts Bartel Lab Whitehead Institute Cambridge, Massachusetts 1) Prediction of Mammalian MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,3, I-hung Shih2,3, Matthew W Jones-Rhoades1,2, David P Bartel1,2, Christopher B Burge1. Cell, Vol. 115 (7), December 26, 2003. 2) Conserved Seed Pairing, Often Flanked by Adenosines, Indicates that Thousands of Human Genes are MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,2, Christopher B Burge1, David P Bartel1,2. Cell, Vol. 120 (1), January 14, 2005. (1) Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA (2) Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA -> artel+Lewis - miRNA Targets Sophia Bardehle

25 Referenzen Bartel Lab: Burge Lab: I-hung_Shih-original-presentation.pdf David Baulcombe (2002) "An RNA Microcosm", Science, 297: ) Ambion: Marianthi Kiriakidou, Peter T. Nelson et al. “A combined computational-experimental approach predicts human microRNA targets” - miRNA Targets Sophia Bardehle

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27 Eingabe: LDLR Ausgabe: 2 verschiede miRNAs Auswahl Details: mi-130a

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