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- MicroRNA - Vorhersagen menschlicher Zielgene Präsentation von Sophia Bardehle Seminar Genomics, Juni 2005 betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ.

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1 - MicroRNA - Vorhersagen menschlicher Zielgene Präsentation von Sophia Bardehle Seminar Genomics, Juni 2005 betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ

2 Inhalt - miRNA Targets - Sophia Bardehle Bedeutung der miRNA TargetScan Target - Vorhersagen Nachweis im Experiment Funktion von Zielgenen News

3 - miRNA Targets - Sophia Bardehle Bedeutung der miRNA endogene, ~22-nt, nicht-codierende RNA in Pflanzen und Tierzellen Funktionen: molekulare Mechanismen unklar bis 2003 miRNA Targets in Vertebraten unbekannt (http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_exp.html)

4 - miRNA Targets - Sophia Bardehle miRNA : Target keine perfekte W-C- Komplementarität miRNA seed = konservierte 5 Region 3 UTR Sequenz der mRNA nach Quelle 1)

5 TargetScan - miRNA Targets - Sophia Bardehle Algorithmus zur Vorhersage von Zielgenen für konservierte miRNA in Wirbeltieren Prinzip: Identifizierung der mRNA, die konservierte Bindung mit miRNA seed eingeht.

6 TargetScan- Methode - miRNA Targets - Sophia Bardehle Grundlage: konservierte miRNA mehrerer Organismen (Rfam Download; Sanger Institute) Annotationen orthologer 3UTR mRNA-Sequenzen (Ensembl EnsMart)

7 TargetScan- Methode - miRNA Targets - Sophia Bardehle 1)Suche nach seed-match,d.h. perfekte W-C-Paarung einer Heptamersequenz zwischen 3 UTR und 5 miRNA seed 2)RNAfold liefert optimale Basenpaarung für 3 Ende der miRNA nach Quelle 1)

8 TargetScan- Methode - miRNA Targets - Sophia Bardehle 3)Berechnung der freien Energien G der miRNA : Target Interaktionen G1G1 G2G2 nach Quelle 1)

9 TargetScan- Methode - miRNA Targets - Sophia Bardehle 4) jede UTR erhält Z-Score nach Quelle 1)

10 TargetScan- Methode - miRNA Targets - Sophia Bardehle 5) Sortierung der Z-Scores der UTRs Rangfolge (Rank R) nach Quelle 1)

11 TargetScan- Methode - miRNA Targets - Sophia Bardehle 6) Targetvorhersage Kriterien:- hoher Z-Score mit Z Z c - Rank R Schwellenwert R c Parameter:Z c, R c und T sind frei wählbar T =Gewichtungsfaktor für Affinität der Basenpaarung Erfahrungswerte: (Analyse von Maus, Ratte, Mensch) T= 20Z c = 4,5R c = 200

12 TargetScan- Ergebnisse - miRNA Targets - Sophia Bardehle Analyse von miRNA : Target Interaktionen Limitierung auf konservierte, high-scoring miRNA : Target Interaktionen > 400 verschiedene Zielgene nach Quelle 1)

13 TargetScan- Ergebnisse - miRNA Targets - Sophia Bardehle signal noise (false positive) signal:noise Verhältnis von 3.5 Ø 3,9 Targets pro miRNA (Klasse: Mammalia) nach Quelle 1)

14 TargetScan- Ergebnisse - miRNA Targets - Sophia Bardehle Bedeutung der Bindung an die 5 Region der miRNA nach Quelle 1)

15 TargetScan- Probleme - miRNA Targets - Sophia Bardehle unvollständige Annotationen für orthologe UTRs reale Targets fallen durch Z-Sore/Rank-Kriterium Bindestellen außerhalb 3 UTR unbeachtet nur konservierte Gene in Betracht gezogen gleichzeitige Interaktionen verschiedener miRNAs an einer UTR ausgeschlossen Fazit: reale Anzahl an Zielgenen pro miRNA ist viel größer

16 Experimenteller Nachweis - miRNA Targets - Sophia Bardehle Methode - Luciferase Assay - Auswahl von 3 UTR menschlicher Zielgene PCR Klonierung in Luciferase Vektor PCR Selektion nach Insert: Wildtyp oder Mutante Transformation des Luciferase Reporter Plasmids in menschliche HeLa-Zellen Messung der Luciferase Aktivität (Lumineszenz) Photinus pyralis

17 Experimenteller Nachweis - miRNA Targets - Sophia Bardehle Luciferase Reporter Vector nach Quelle 1)

18 Experimenteller Nachweis - miRNA Targets - Sophia Bardehle Interpretation Wildtype:miRNA : Target site Bindung Luciferaseexpression geringe Lumineszenz Mutante: lückenhafte miRNA : Target Basenpaarung Luciferaseexpression hohe Signale Luciferase

19 Experimenteller Nachweis - miRNA Targets - Sophia Bardehle Luciferaseaktivität nach Quelle 1)

20 Experimenteller Nachweis - miRNA Targets - Sophia Bardehle Ergebnis: 15 vermutliche Zielgene (TargetScan) getestet 11 Gene experimentell bestätigt ca. 30 % der Vorhersagen sind false positive

21 Funktionen von Zielgenen - miRNA Targets - Sophia Bardehle große funktionelle Diversität Beispiele TF:High-mobility-Proteine Signaltransduktion:STAT3 Rezeptor:LDL-R Strukturproteine:Collagen Enzyme:G6PD Translationsregulator:COP9 > 400 Zielgene konserviert zwischen Maus, Ratte Mensch

22 Funktion von Zielgenen - miRNA Targets - Sophia Bardehle GO IDBiological ProcessmiRNAs all orthologous genes no assignment/unknown130 (32%)5737 (40%) known biological process270 (68%)8802 (60%) GO: development52 (13%)1192 (8%) GO: protein metabolism60 (15%)1788 (12%) GO: cell growth and/or maintenance92 (23%)2742 (19%) GO: transport44 (11%)1442 (10%) GO: cell proliferation23 (6%)764 (5%) GO: cell communication76 (19%)2704 (19%) GO: signal transduction61 (15%)2217 (15%) GO: phosphorus metabolism30 (8%)589 (4%) GO: response to external stimulus28 (7%)1065 (7%) GO: regulation of transcription 82 (21%)1210 (8%) GO: transcription84 (21%)1310 (9%)

23 News - miRNA Targets - Sophia Bardehle TargetScanS Genome-Analyse (signal:noise ) Identifizierung von 5300 meschlichen Genen, die durch miRNA reguliert werden (~30% des Genoms) TargetScan Webserver Datenbank zur Suche nach konserv. miRNA Targets bzw. Zielgenen

24 Referenzen - miRNA Targets - Sophia Bardehle 1) Prediction of Mammalian MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,3, I-hung Shih2,3, Matthew W Jones-Rhoades1,2, David P Bartel1,2, Christopher B Burge1. Cell, Vol. 115 (7), December 26, Benjamin P LewisI-hung ShihMatthew W Jones-RhoadesDavid P BartelChristopher B BurgeCell 2) Conserved Seed Pairing, Often Flanked by Adenosines, Indicates that Thousands of Human Genes are MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,2, Christopher B Burge1, David P Bartel1,2. Cell, Vol. 120 (1), January 14, Benjamin P LewisChristopher B BurgeDavid P BartelCell

25 Referenzen - miRNA Targets - Sophia Bardehle 3)Bartel Lab: 4)Burge Lab: 5)I-hung_Shih-original-presentation.pdf 6)David Baulcombe (2002) "An RNA Microcosm", Science, 297: ) 7)Ambion: 8)Marianthi Kiriakidou, Peter T. Nelson et al. A combined computational-experimental approach predicts human microRNA targets

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