V7: Aufklärung von Proteinstrukturen in der nahen Zukunft

Präsentation zum Thema: "V7: Aufklärung von Proteinstrukturen in der nahen Zukunft"—  Präsentation transkript:

1 V7: Aufklärung von Proteinstrukturen in der nahen Zukunft
Structural genomics soll die Strukturen von Proteinen vor allem mit neuen Faltungsmustern („folds“) aufklären. Bedeutung von Folds. Grundsätzliches zu Struktur – Funktion Beziehung. Definition von Folds: siehe V6 Homologiemodellierung der Strukturen aller verwandten Proteine unter Verwendung der bekannten 3D-Strukturen als Vorlagen.

2 Analyse einer unbekannten Sequenz
Input: neue Proteinsequenz Experimentelle Daten vorhanden? Multiples Sequenzalignment Suche in Sequenzdatenbanken nach identischer Sequenz bzw. ähnlichen Sequenzen Erkenne Domänen Gibt es ähnliche Sequenz mit bekannter 3D-Struktur? Nein Vorhersage der Sekundärstruktur Zuordnung eines Protein-Folds Analyse dieses Folds, Nachbarn? Ja Ja Fold erkannt? Alignment der Sekundärstrukturen. Nein Modellierung der Proteinstruktur durch Homologiemodellierung Alignment der Sequenz mit einer Target-Struktur Ab inito Vorhersage der Tertiärstruktur 3D-Proteinstruktur Nach Rob Russell, gtsp/flowchart2.html Kann man Funktion zuordnen?

3 Integrative Datenbankanalyse
Integrative database analysis in structural genomics M. Gerstein, Nat. Struct. Biol. 7, 960 (2000) 10 most common folds in yeast genome (= number of gene duplications); table shows ranking according to various measures. It shows how common popular folds in yeast occur in other genomes and in the PDB data base; variety of functions; level of expression.

4 Integrative Datenbankanalyse
Gibt es Faltungsmuster, die es nur in bestimmten phylogenetischen Gruppen gibt? Diese Proteine könnte gute Targets für selektive Inhibitoren sein. Die vorangehende Abbildung zeigt, dass bestimmte Faltungsmuster in allen Organismen vorkommen. Das Ziel von structural genomics könnte nun sein, die Lücken zwischen den bekannten Regionen zu füllen.

5 Beziehung zwischen Fold, Funktion, und WWs
- die meisten Proteine derselben Proteinfaltung haben dieselbe (oder eine von zwei) Funktionen  Kenntnis des “folds” ermöglicht oft Funktionszuordnung!  “fold prediction” alleine ist bereits sehr wertvoll. Integrative database analysis in structural genomics M. Gerstein, Nat. Struct. Biol. 7, 960 (2000)

6 Proteinstrukturmodellierung für Structural Genomics
Grad an Sequenzidentität zwischen den bekannten Proteinstrukturen und den Proteinen von M. Genitalium. Für 333 von 479 Sequenzen konnte mindestens für ein Stück von 30 Residuen ein Modell erstellt oder ein Fold zugeordnet werden. Protein structure modeling for structural genomics. R. Sánchez et al. Nat. Struct. Biol. 7, 986 - 990 (2000)

7 Modellierung von Proteinstrukturen
Protein structure modeling for structural genomics. R. Sánchez et al. Nat. Struct. Biol. 7, 986 - 990 (2000)

8 Homologie/Komperative Modellierung
Qualität der Modellierung hängt von Sequenzidentität mit Vorlage ab. Protein structure modeling for structural genomics. R. Sánchez et al. Nat. Struct. Biol. 7, 986 - 990 (2000)

9 Genomweite Strukturmodellierung
Effekt des Wachstums der PDB-Datenbank auf die Zahl der Protein des Bakteriums M. Genitalium, deren Fold und Struktur im jeweiligen Jahr vorhergesagt werden konnte. Homologie-Modellierung ist nicht aufwendig, dauert pro Struktur nur wenige Minuten. Akkurate Modellierung von Loops und Seitenketten kann jedoch erheblich aufwendiger sein. Grün: Proteine mit Modell oder fold assignment aus PSI-BLAST für mindestens 30 ihrer Residuen. Blau: nur Modell Rot: Anteil der Residuen des Genoms, die in Modell oder fold assignment vorkommen. R. Sánchez et al. Nat. Struct. Biol. 7, 986 - 990 (2000)

10 Schliesse von Struktur auf Funktion?
From structure to function: Approaches and limitations J. M. Thornton et al. Nat. Struct. Biol. 7, 991  (2000)

11 Faltung  homologe Superfamilie  Funktion
Verteilung homologer Superfamilien in CATH Klassifizierung von Proteinstrukturen. Obwohl manche Folds sehr unterschiedliche Funktionen ausüben können, enthalten 556 Folds jeweils nur eine homologe Superfamilie. From structure to function: Approaches and limitations J. M. Thornton et al. Nat. Struct. Biol. 7, 991  (2000)

12 Faltung  homologe Superfamilie  Funktion
Konservierung von Enzymfunktion (durch EC-Nummer definiert) innerhalb einer homologen Superfamilie ist relativ gut erfüllt. Dennoch gibt es eine Reihe von absoluten Ausnahmen. From structure to function: Approaches and limitations J. M.Thornton et al. Nat. Struct. Biol. 7, 991  (2000) Ähnlichkeit der Enzymfunktion

13 Faltung  homologe Superfamilie  Funktion
Diversität der Enzymfunktion in der Familie der Typ1- Aspartat-Aminotransferasen: gezeigt sind die verschiedenen EC-Klassifizierungen von Mitgliedern dieser Superfamilie. Dies ist ein Beispiel für eine der wenigen Superfamilien, bei denen die Zuordnung Fold  Funktion nicht eindeutig ist. From structure to function: Approaches and limitations J. M.Thornton et al. Nat. Struct. Biol. 7, 991  (2000)

14 Aktives Zentrum der Aspartat Proteasen
Kristallstruktur des menschlichen Pepsins. Beide Domänen steuern Residuen für aktives Zentrum bei. From structure to function: Approaches and limitations J. M.Thornton et al. Nat. Struct. Biol. 7, 991  (2000)

15 Aktives Zentrum der Aspartat Proteasen
Superposition der Residuen des aktiven Zentrums in 18 unterschiedlichen Aspartat-Protease Proteinfamilien  das aktive Zentrum der Aspartat-Protease kann durch die Position von 8 Atomen beschrieben werden. From structure to function: Approaches and limitations J. M.Thornton et al. Nat. Struct. Biol. 7, 991  (2000)

16 Genomweite Sequenzanalyse bzw
Genomweite Sequenzanalyse bzw. Sequenzvergleich: Auswahl der Target-Proteine Genauigkeit der CASP Proteinstrukturen als Funktion der Sequenzidentität von Ziel und Vorlage. Sobald die Identität unter 30% sinkt, nimmt die Abweichung der Modelle von der korrekten exp. Struktur schnell zu. Completeness in structural genomics D. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559  (2001)

17 Korrektheit von Alignments
Die Hauptursache für diesen Effekt sind Fehler im Alignment von Zielprotein und Vorlage. Hier ist der Anteil der korrekt alignierten Residuen gezeigt (bewertet anhand der 3D-Struktur). Completeness in structural genomics D. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559  (2001)

18 Strukturelle Abdeckung der Sequenzdatenbanken
Zahl an (Struktur-)Modellen, die korrekt erzeugt werden können als Funktion der Sequenzidentität (x-Achse) und des passenden Sequenzabschnitts (y-Achse). Der rechte-obere Quadrant umfasst 19% aller Proteine in Swissprot+TrEMBL, für die eine zuverlässige Vorlage in der PDB-Datenbank existiert. Completeness in structural genomics D. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559  (2001)

19 Strukturelle Information für gesamte Genome
Completeness in structural genomics. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559 (2001)

20 Strukturelle Abdeckung der ras-Proteinfamilie
Ras-Proteine in Hefe. Der Abstand zwischen den Proteinen entspricht 100% - Sequenzidentität. Mit 1 Struktur (YPT6) kann man alle Proteine aufgrund von 20% Identität modellieren (grüner Kreis), mit 5 Strukturen alle mit 30% Identität (rote Kreise). Completeness in structural Genomics. D. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559  (2001)

21 Wie viele Proteinstrukturen werden benötigt?
Geplante Modellierung aller Nichtmembran-proteine. Completeness in structural Genomics. D. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559  (2001)

22 Wie viele Strukturen werden praktisch benötigt?
Wie gut ist die strukturelle Abdeckung, wenn man Erfolgsraten von 100% (1:1) bis runter zu 10% (1:10) für die Kristallisationsprojekte ansetzt? Man kann auch für geringere Erfolgsraten eine ähnlich gute Abdeckung erwarten! Completeness in structural Genomics. D. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559  (2001)

23 Auswahl der zu kristallisierenden Proteine
Blau: optimale Auswahl der Targetproteine Grün: Targetproteine werden zufällig ausgewählt. Man benötigt 7 x mehr Strukturen um 90% Abdeckung zu erreichen. Rot: Auswahl ebenfalls zufällig unter der Bedingung, dass die Ähnlichkeit zu allen anderen Strukturen < 30% liegt. Completeness in structural Genomics. D. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559  (2001)

24 Genomweite Sequenzanalyse bzw. Sequenzvergleich
Etwa die Hälfte aller Sequenzen und damit etwa ein Viertel aller Residuen in bekannten Genomen kann einer der 2000 bekannten Pfam Proteinfamilien zugeordnet werden. Daher erwarten wir ca Proteinfamilien. Für die strukturelle Abdeckung der 2000 bekannten Proteinfamilien zu 90% sind etwa 4000 Proteinstrukturen notwendig. Damit sind bei optimaler Auswahl der Targetproteine Strukturbestim-mungen notwendig. Completeness in structural Genomics. D. Vitkup et al. Nat. Struct. Biol. 8, 559  (2001)

25 Methode zur Fold-Erkennung: Threading
Gegeben: Sequenz: IVACIVSTEYDVMKAAR… Ein Datenbank von möglichen Proteinstrukturen (“folds”) Bilde die Sequenz auf jeden fold ab Bestimme anhand einer Bewertungsfunktion, welcher Fold am besten zu dieser Sequenz passt.

26 „New view of protein folding“:
Faltung entlang trichterähnlichen Energielandschaften Bryngelson, Wolynes, PNAS (1987) Gradient  Rauhigkeit beschleunigt bremst Faltung Faltung “Frustration” Brooks, Gruebele, Onuchic, Wolynes, PNAS 95, (1998)

27 Fold Optimierung Zwei Sorten von Seitenketten: hydrophob und polar
Einfache Gittermodelle (HP-Modelle) Zwei Sorten von Seitenketten: hydrophob und polar 2-D oder 3-D Gitter Treibende Kräfte: hydrophober Kollaps – es ist günstig, Kontakte zwischen hydropoben Seitenketten zu bilden Bewertung = Anzahl an HH Kontakten

28 HP-Gittermodelle Ken Dill ~ 1997 Vorteil solch einfacher Modelle:
man kann den Konformationsraum systematisch absuchen.

29 Simulating the folding process
How long does protein folding take? What timescale can we bridge by MD simulations?  Can we simulate a folding process?

30 Folding simulations Can one simulate a folding process by MD simulations? s simulation of 36-residue villin headpiece exp. folding time: between 10 – 100 s, Tm = 70 C - contains 3 short helices (NMR) connected by loop and turn - closely packed hydrophobic core 4 months of CPU time on 256 processor Cray T3D and T3E

31 Folding of villin headpiece
unfolded partially folded native structures comparison of native (red) most stable cluster and most stable cluster (blue) Duan & Kollman, Science 282, 740 (1998)

32 Folding of villin head piece
(A) fractional helical content (C) Radius of gyration and RMSD from native (B) fractional native content (D) solvation free energy (Eisenberg params) Duan & Kollman, Science 282, 740 (1998)

33 Homologie-basierte Proteinmodellierung (SwissModel)
Methode: Wissensbasierter Ansatz. Erfordernis: Mindestens 1 bekannte 3D-Struktur eines verwandten Proteins, Prozedur: Superposition der verwandten 3D-Strukturen Erzeugung eines multiplen Sequenzalignments mit der Zielsequenz. Generierung eines Frameworks für die neue Sequenz. Konstruiere fehlende Loops. Vervollständige und korrigieren das Proteinrückgrat. Korrigiere die Seitenketten. Überprüfe die Qualität der modellierten Struktur und deren Packung. Strukturverfeinerung durch Energieminimierung und Moleküldynamik. SWISS-MODEL.html

34 Überlagerung der 3D-Strukturen
Regionen mit Sequenzähnlichkeit werden automatisch ausgewählt und ihre Residuen in 3D überlagert. Diese erste Auswahl wird weiter verfeinert. SWISS-MODEL.html

35 3D Framework für die neue Sequenz
Für alle Atome, die eine ähnliche Position besitzen und vermutlich eine strukturelle Entsprechung in der neuen Struktur besitzen, werden gemittelte Positionen als Framework-Koordinaten bestimmt. Seitenketten mit völlig inkorrekter Geometrie werden entfernt. Matrix mit Gewichten für lokale Ähnlichkeit. SWISS-MODEL.html

36 Konstruktion fehlender Loops
Basierend auf den Verankerungen der Loops werden wird eine Datenbank bekannter Loopfragmente in der PDB-Datenbank durchsucht. Für den neuen Loop verwendet man entweder das am besten passende Fragment oder ein Framework aus den 5 besten Fragmenten. Der Torsionsraum der Loopresiduen wird durchsucht - 7 erlaubte Kombinationen der - Winkel - benötigter Raum für den gesamten Loop SWISS-MODEL.html

37 Rekonstruktion von fehlendem Proteinrückgrat
Das Rückgrat wird auf der Grundlage von C -Positionen konstruiert. - 7 Kombinationen der - Winkel sind erlaubt. - Durchsuche Datenbank für Backbone-Fragmente mit Fenster aus 5 Residuen, Verwende die Koordinaten der 3 zentralen Residuen des am besten passenden Fragments.

38 Konstruktion unvollständiger/fehlender Seitenketten
Verwende Bibliothek erlaubter Seitenketten-Rotamere geordnet nach der Häufigkeit des Auftretens in der PDB-Datenbank. Erst werden verdrehte (aber komplette) Seitenketten korrigiert. fehlende Seitenketten werden aus der Rotamer-Bibliothek ergänzt. Teste dabei, ob van-der-Waals Überlapps auftreten und ob die Torsisonswinkel in erlaubten Bereichen liegen. SWISS-MODEL.html

39 Überprüfe die Qualität der 3D-Modelle
Analysiere 3D-Umgebung jeder Seitenkette. Erlaubt die Identifizierung missgefalteter Regionen. Auch: WHATCHECK SWISS-MODEL.html

40 Analyse der Packungsdichte eines atomaren Modells
Berechne, welche Bereiche des Proteins für eine kleine Probe zugänglich sind (Connolly-Oberfläche bzw. Kubisches Gitter). Algorithmus entdeckt Oberflächen innerhalb und ausserhalb des Proteins. Der Vergleich von Grösse und Verteilung von internen Cavities zwischen Modell und Kristallstruktur-Vorlage erlaubt es, Fehler im Modell aufzuspüren. SWISS-MODEL.html

41 Bewertung der Qualität eines Homologiemodells 1
Bewertung der Qualität eines Homologiemodells 1. Allgemeine Gesichtspunkte Ein Modell wird als falsch angesehen, wenn mindestens eines seiner strukturellen Elemente gegenüber dem Rest des Modells falsch angeordnet ist. Dies kann durch ein falsches Sequenzalignment entstehen. Das Modell kann dennoch korrekte Stereochemie besitzen. Man kann ein Modell als ungenau ansehen wenn seine atomare Koordinaten mehr als 0.5 Å von einer experimentellen Kontrollstruktur abweichen. Ungenauigkeiten können auch in der Stereochemie (Bindungslängen und –winkel auftreten). Dies kann leicht mit WhatCheck überprüft werden. Statistische Paarpotentiale für die Verteilung von Aminosäuren in bekannten Proteinen erlauben manchmal die Aufspürung von fehlerhaften Modellen.

42 2. Fehlerquellen Die Qualität eines Modells hängt von 2 Kriterien ab
Seine Korrektheit hängt von der Qualität des Sequenzalignments ab. Seine Genauigkeit wird durch seine Abweichung von einer (zukünftig zu bestimmenden) experimentellen Struktur bestimmt. Strukturelle Abweichungen haben 2 Ursachen - der inherente Fehler der Modellierungsprozedur - durch Umgebung und Methoden der Datenerfassung bewirkte Variationen der experimentellen Strukturen, die als Vorlage verwendet werden. Ein durch komparative Methoden abgeleitetes Protein-Modell kann nicht genauer sein als der Unterschied zwischen einer NMR-Struktur und einer Kristallstruktur desselben Proteins.

43 3 Proteinkern und Loops Fast jedes Proteinmodell enthält nicht-konservierte Loops, die als die am wenigsten zuverlässigen Teile des Proteinmodells angesehen werden können. Andererseits sind diese Bereiche der Struktur oft auch am flexibelsten – hohe Temperaturfaktoren in Kristallstrukturen oder hohe Unterschiede zwischen verschiedenen (gleichsam gültigen) NMR-Strukturen. Die Residuen im Proteinkern werden gewöhnlich fast in der identischen Orientierung wie in experimentellen Kontrollstrukturen modelliert. Residuen an der Proteinoberfläche zeigen grössere Abweichungen.

44 Einordnung von Proteinmodellen in 3 Kategorien
Modelle, die auf falschen Alignments zwischen Vorlage und Zielprotein basieren. Strategie: konstruiere mehrere Modelle für unterschiedliche Alignments. Wähle das am besten erscheinende Modell. Modelle, die auf korrekten Alignments beruhen, können für zielgerichtete Mutagenese-Experimente hilfreich sein. Sind oft nicht zuverlässig genug für detaillierte Untersuchung von Ligandenbindung. Modelle, die auf einer hohen Sequenzidentität (> 70%) mit der Vorlage beruhen. Solche Modelle können in Drug Design Projekten verwendet werden. Fehler sind jedoch immer, also auch bei sehr hoher Identität möglich.

45 Test für die Zuverlässigkeit von SwissModell
3DCrunch-Projekt von Expasy zusammen mit SGI. Generiere „Homologie-Modelle“ für Proteine mit bekannter 3D-Struktur. Die Vorlagen besaßen 25 – 95 % Sequenzidentität mit dem Zielprotein. 1200 Kontrolle-Modelle. Grad der Identität [%] Modell innerhalb von x Å RMSD zur Vorlage < 1 < 2 < 3 < 4 < 5 > 5 /SWISS-MODEL.html

46 Zusammenfassung Gemeinsamer Kern von Proteinen mit 50% Sequenzidentität besitzt ca. 1 Å RMSD Dies gilt sogar für absolute identische Sequenzen. Der zuverlässigste Teil eines Proteinmodells ist der Sequenzabschnitt, den es mit der Vorlage gemeinsam hat. Die größten Abweichungen liegen in den konstruierten Schleifen. Die Wahl der Modellvorlage ist entscheidend! Die An- oder Abwesenheit von Ko-faktoren, anderen Untereinheiten oder Substraten kann Proteinkonformation sehr beeinflussen und somit alle Modelle, die von ihnen abgeleitet werden. Jeder Fehler im Alignment produziert falsche Modelle! Solche Alignment-Fehler treten bei Sequenzidentität unter 40% auf.

47 IV The importance of being unfolded?
Anscheinend sind nicht wenige Proteine der Zelle einen Großteil der Zeit teilweise entfaltet (P.E. Wright, H.J. Dyson, J. Mol. Biol. 293, 321 (1999)) Dies klingt sehr unerwartet. Was wären mögliche biologische Vorteile davon? (1) Entfaltete Proteine können schneller abgebaut werden  kann für Regulation eines schnellen Zellzyklus erforderlich sein. (2) Molekulare Erkennung ist schneller, wenn Faltung und Bindung gekoppelt sind (3) Loopstrukturen können viele biologische Targets erkennen  wichtig für Kommunikation und Regulierung bzw. Bildung großer Komplexe? (4) Entfaltete Proteine können schnell in andere Zellkompartments transportiert werden.

48 NORS regions: no regular secondary structure
NORS regions are defined to have at least 70 consecutive residues with less than 12% regular secondary structure (helix or strand). We found four types of proteins. (A) Connecting loops: long loops that connect two domains or chains (shown Formate Dehydrogenase H, 1AA6). of interactions. (B) Loopy ends: long N- or C-terminal regions that lack regular secondary structure (shown Hexon from adenovirus type 2, 1DHX). (C) Loopy wraps: long loopy regions wrapping around globular domains (shown Class II chitinase, 2BAA. (D) Loopy domains: entire structures that have almost no regular secondary structure (shown extra-cellular domain of T beta RI, 1TBI). Liu, Tan, Rost, J Mol Biol (2002) 332, 53-64

49 Many NORS regions predicted in proteomes
We predicted many NORS regions in 31 entirely sequenced organisms. NORS proteins appeared particularly abundant in eukaryotes. (A) gives the percentage of proteins in respective proteome for which at least one NORS region is predicted. High enrichment in eukaryotic proteomes! (B) illustrates the percentage of all the residues of the respective proteome for which a NORS region is predicted. (C) gives the percentage of all predicted NORS regions that are between N and N+10 residues long (note that, by definition, NORS regions are longer than 70 residues). Surprisingly, almost 15% of all the predicted NORS regions extend over more than 200 residues (inset of C). Liu, Tan, Rost, J Mol Biol (2002) 332, 53-64

50 NORS regions use particular amino acids
The height of the one-letter amino acid code is proportional to the abundance of the respective acid in each data set. The actual value is the difference in occurrence with respect to the frequency observed in a sequence-unique subset of PDB: . Inverted letters indicate acids that are less frequent than 'expected'. The amino acids are sorted by 'flexibility' , with the more rigid ones on the left. Overall, NORS regions are as abundant in more flexible residues as loop regions in PDB . However, we found considerably more Serine (S), Glutamine (Q), and Glycine (G) and considerably fewer Arginine (R), Aspartic acid (D), Glutamic acid (E), Tryptophan (W), and Phenylalanine (F) in NORS regions than in loop regions, in general. Liu, Tan, Rost, J Mol Biol (2002) 332, 53-64

51 Prion: ein ungeklärtes Beispiel für misgefaltete Proteine
Das Prion-Protein PrPc: ist ein normales zelluläres Glycoprotein ist an die Plasmamembran über einen GPI-Anker angehängt hat 209 Aminosäuren Seine genaue Funktion ist unbekannt. Cu2+ Speicherung, Erinnerung? Struktur aus NMR-Bestimmungen bekannt: Die N-terminale Region ist sehr flexibel und meist ungeordnet. C-terminale Region enthält 3 -Helices, 2 kurze -Stränge PrPc wird schnell durch Proteinase K abgebaut