Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge1 V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung – anschaulich betrachtet Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das.

Ähnliche Präsentationen


Präsentation zum Thema: "8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge1 V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung – anschaulich betrachtet Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das."—  Präsentation transkript:

1 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge1 V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung – anschaulich betrachtet Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das aktive Zentrum? (Docking wird hier nicht behandelt – siehe Spezialvorlesungen von A. Kämper und A. Hildebrandt/D. Neumann im SS05) Wie stark binden Liganden an Proteine? Wie kann man die Affinität des Liganden verbessern?

2 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge2 beta-Trypsin:Benzamidin (3ptb) Enge, sehr polare Bindungstasche auf Proteinoberfläche. Amidin-Gruppen des Liganden bilden 4 H- Bindungen mit Carboxylgruppen des Proteins (Trypsin) aus. Benzolring passt optimal in hydro- phobe Tasche.

3 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge3 Cytochrome P450cam : Kampher (2cpp) Weites, recht unpolares aktives Zentrum im Proteininneren. Hämgruppe katalysiert Reaktion. Partielle Desolvatation. Wie gelangt Substrat hinein?

4 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge4 Maus-Antikörper McPC-603:Phosphocholine (2mcp) Bindungstasche auf Proteinoberfläche wird durch drei hypervariable Loops geformt.

5 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge5 Streptavidin:Biotin (1stp) Sehr polare, tiefe Bindungstasche. Außerordentlich starke Affinität.

6 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge6 HIV-1 Protease:XK-263 Inhibitor (1hvr) Inhibitor XK-263 stammt von Merck-Dupont. Er enthält eine 7-Ring zyklische Urea-Einheit mit Phenyl- und Naphtyl-Ringen. Die CO-Gruppe ahmt das ansonsten konservierte Wassermolekül 301 nach und verdrängt es. Der tiefere Teil des zyklischen Urea-Rings enthält zwei benachbarte Hydroxylgruppen, die H-Bindungen mit den katalytischen Aspartat-Residuen bilden.

7 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge7 Identifikation von funktionellen Residuen 1 Funktionelle bzw. katalytische Residuen werden traditionell in (hoch) konservierten Regionen von Multiple Sequence Alignments erwartet evtl. Kopplung mit Information über 3D-Struktur 2: finde Residuen, die Proteinstruktur destabilisieren. Grund: Funktionelle Residuen im Proteininneren sind oft energetisch ungünstig. Funktionalität auf Kosten von Stabilität. 3: finde Löcher oder Einbuchtungen in Proteinstruktur. Hier vorgestellt: integrierte Methode, die 1 -3 implementiert. Möglichkeit für funktionelle Annotation von Proteinen mit unbekannter Funktion.

8 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge8 Wo ist das aktive Zentrum I? Auswahl von 49 Enzymen. Kriterien: - Auflösung 2.0 Å - funktionelle Residuen sind bekannt (in Swissprot-Eintrag in ACT_SITE) - enthalten nur eine Domäne (SCOP Datenbank) - die SCOP-Einträge sind unterschiedlich - es gibt 10 homologe Sequenzen mit Blast E-Wert < katalytische Residuen: 22 His 17 Asp, Glu 10 Cys 8 Ser 7 Arg, Lys Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003) 5 Tyr 3 Asn 2 Thr

9 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge9 Repräsentative Enzyme PDBProtein Länge Auflösung EC Zahl Zahl und Namen der SCOP Seq. katalytischen Residuen

10 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge10 Repräsentative Enzyme

11 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge11 Fitness-Funktion - Bewertung der Seitenketten-Konformation entsprechend Rotamer-Bibliothek - Seitenketten-Packung (wissensbasiert) - Hydratation (wissensbasiert) - Analyse der Proteinoberfläche (MSP-Programm): Zuordnung zu den einzelnen Residuen - elektrostatische Energie: AMBER-Partialladungen elektrostatisches Potential (aus Poisson-Boltzmann-Rechnung) Jeder Score(S), Rang (R) und Position (L) werden gegen den Mittelwert und die Standardabweichung für jeden Aminosäuretyp normalisiert. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

12 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge12 Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Beispiel: 3D-Profil für Lysozym aus Hühnereiweiss. D52 ist katal. Residue. native Hydratations- lokaleD52 hat sehr schlechten Rang. D.h. Residue klasse Struktures wäre günstig D52 zu ersetzen. Katalytische Residuen sind stets un- stabiler als nicht-katalytische. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003) Score Rang Score native native beste Residue Residue Residue

13 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge13 Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Flussdiagramm der Vorhersagemethode. - Links oben Analyse der Konservierung. - Rechts oben Analyse der Position in 3D-Struktur bzw. Stabilität der Mutantenproteine - untere Hälfte trifft für verschiedene Aminosäuretypen (1-Letter-code) die Entscheidung, ob katalytische Residuen vorliegen. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

14 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge14 Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003) Proteinstrukturen mit unbekannter Funktion. Die vorgeschlagenen katalytischen Residuen sind markiert.

15 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge15 Wo ist das aktive Zentrum II Analyse mit elektrostatischen Kontinuumsrechnungen Die Titrationszustände der meisten Aminosäuren folgen der Henderson-Hasselbalch-Gleichung. Berechne Titrationskurven für 3 Enzyme mit UHBD. TIM und AR haben eine sehr ähnliche Strukturen, katalysieren aber ganz unterschiedliche Reaktionen. AR und PMI haben sehr verschiedene Strukturen, katalysieren aber ähnliche Reaktionen. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

16 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge16 Theoretische Titrationskurven Titrationskurven aller His-Residuen in TIM Triosephosphat Isomerase (TIM) katalysiert die Isomerierung von D-Glyceraldehyd- 3-Phosphat zu Dihydroxyaceton-Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: His95, Glu165, Lys112, Tyr164. Davon liegen H95, E165 und Y164 eng beieinander. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

17 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge17 Titrationskurven aller Tyr-Residuen in AR Theoretische Titrationskurven Aldose-Reduktase (AR) katalysiert die Reduktion einer Aldehydgruppe von Aldose zu einem Alkohol. Man findet 7 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: Tyr48, Cys298, Glu185, Lys21, Lys77, Tyr107, Tyr209. Tyr48, His110 und Cys298 bilden das aktive Zentrum. Die anderen Residuen liegen in der Nähe. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

18 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge18 Titrationskurven aller Lys-Residuen in PMI Theoretische Titrationskurven PMI katalysiert die Interkonversion von Mannose-6-Phosphat und Fructose-6- Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: His135, Lys100, Lys136, Tyr287. Alle liegen eng beieinander, die ersten 3 wohl im aktiven Zentrum und His135 nahe bei Lys136. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

19 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge19 Weitere Beispiele PDB ID Name ChemieResiduen mit auffälligen Titrationskurven 1AMQ Aspartat [H189, Y225, K258, R266, C191, C192], aminotransferase * Transamination [Y256], [Y295], [H301] * 1CSE1CSE Subtilisin Peptidhydrolyse [D32, H64] Carlsberg (Serin-Protease) 1EA51EA5 Acetylcholinesterase Ester Hydrolyse [Y130, E199, E327, H440, D392], [Y148], [H398], [H425] 1HKA1HKA 6-Hydroxymethyl- * Kinase [D97, H115] * 7,8-dihydropterin pyrophosphate kinase 1OPY1OPY 3-Keto- 5 -Steroid Isomerase[Y16, Y32, Y57], [C81] isomerase 1PIP1PIP Papain Peptidhydrolyse [C25, H159], (Cys Protease) [K17, K174, Y186], [R59], [R96] 1PSO1PSO Pepsin Peptidhydrolyse [D32, D215, D303], [D11] (Säure-Protease) 1WBA1WBA Winged bean Speicherung - keine keine albuminEnzymfunktion Residue im zweiter Schale. Residue im aktiven Zentrum Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

20 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge20 Fazit Mittels elektrostatischer Kontinuumsrechnungen für bekannte Kristallstrukturen von Proteinen wurde für verschiedene externe pH-Werte die energetisch optimale Gesamtladung der Proteine berechnet. Aktive Zentren von Enzymen enthalten oft mehrere polare bzw. geladene Seitenketten um die chemische Umwandlung zu katalysieren. Deren Titrationszustände sind eng aneinander gekoppelt und zeigen im Vergleich zu isolierten Seitenketten sehr ungewöhnliche Titrationskurven. Diese Methode erlaubt also die Position von aktiven Zentren allein aufgrund der Proteinstruktur zu erkennen. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

21 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge21 Wie stark binden Liganden an Proteine? Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

22 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge22 exp. Affinitäten von Protein:Liganden Komplexen # Atome Ligand Target Typ -log K 1 1 Ca 2+ Amino-transferase IM 6.70IM: Metallionischer Inhibitor 1 Hg 2+ Uroporphy-synthase IM Mn 2+ Inositol-phosphataseIM Fe 3+ Hydroxylase IM Ag + Arylformamidase IM F - Phosphotransferase IA 4.55IA: kleiner anionischer Inhibitor 1 S 2- Peroxidase IA Xe Myoglobin L 2.30L: Ligand (Agonist oder Antagonist) 1 NH 3 Meamine glutamate transferase I 1.79 I: Inhibitor 2 COMyoglobin L O 2 Myoglobin L Cyanide Methane oxygenase IA Hydroxylamine Glycerol oxidase IC 5.92 IC: potentiell kovalente Wechselwirkung 3 Azide Glycerol oxidase IA Ethylamine Protease II Thioacetamide Methan monooxygenase I NO 3 - Carbonate deydratase IA Vanadate Phytase IA Thiosemicarbazide Methane monooxygen. I SO 4 2- Creatine kinase IA Iodoacetamide Methyl transferase IC Putrescine Spermine synthase I Aminooxyacetic acid Aminotransferase I Oxalat Lactate dehydrogenase IA Aminobutyid acid Neuromanidase transmitter L L-Cysteine Serine acetyl transferase I Aminomethiozolidine Methyl transferase I Muscimol -aminobutylicacid agonist L Bromopyrimidone Cytosine deaminase I Phosphonoacetic acid DNA polymerase I Acetopyruvate Acetoacetate decarboxylase I Methyl iodotyrosine Tyrosine monooxygenase I Nitrooxazolidinone Aldehyde dehydrogenase I Benzamidine Trypsin I 4.77

23 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge23 experimentelle Protein-Liganden Affinitäten 10 Allopurinol Xanthine oxidase I Acetylcholine Cholinergic receptor L Cabachol Cholinergic receptor L Mercapto oxoglutaric Isocitrate dehydrogenase I Diethyl pyrocarbonate Ca2+ transmitter L Dopamine,, -androgen receptor L Norepinephrine Adrenergic agonist L Nicotine Nicotinic receptor L Hydroxybenzyl-Me3NR4 Acetycholiesterase I I Tiamenidine -Adrenergic agonist L Serotonin 5-Hydroxy tryptamine receptor L Benzyl mercaptopropionate Carboxypeptidase I Guanabenz -Adrenergic receptor L Methylenpenicillanic -Lactamase I Captopril Carboxypeptidase I Aminoclonidine L Guanfacine -Adrenergic agonist L Isatin derivative Rhino protease I Acetophenone derivativeACEsterase IC Biotin Streptavidin L Naphazoline Adrenergic L Melatonin Melatonin receptor L Guanine derivative Purine nucleoside phosphorylase I piperoxan antihyper. receptor L Iodomelatonin Melanin receptor L Alprenolol -adrenergic receptor L Phosphoramidon Metalloproteinase I Vesamicol Vesamicol receptor L Propranolol -adrenergic receptor L Trimethopri der Dihydrofolate reductase I Estradiol Steroid receptor L Melatonin derivative Melatonin receptor L Vesamicol derivative Vesamicol receptor L Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I Triprolidine Histamine antagonist L Trimethoprim dihydrofolate reductase I 8.44 # Atome Ligand Target Typ -log K 1 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

24 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge24 22 Amitriptylinoxide Antidepressant L Mazindol derivative Dopamine transporter L Indolyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L Isatin derivative Rhino protease I Vesamicol der. VR L Neuraminic acid der. Sialidase I Melatonin der. melamin receptor L Vesamicol der. VR L Vesamicol der. VR L Isatin der. Rhino protease I Methadone Narcotic L Melatonin der. Melamin receptor L Corticosterone Steroid receptor L Isatin der. Rhino protease I Aldosterone Steroid receptor L Haloperidol Antipsychotic L Yohimbine -2 adrenergic receptor L Isatin der. Rhino protease I Vesamicol der. VR L Dexetimide Anticholinergic L Dehydrosinefungin mRNA Me trans. I Vesamicol der. VR L Indoyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L Prazosin 1-adrenergic agonist L Spiperone L Ketanserin Serotonin antagonist L Dextromoramide Analgesic L Peptide phosphonates Carboxy peptidase IM Domperidone Dopamine antagonist L Etorphine Narcotic L 9.91 # Atome Ligand Target Typ -log K 1 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999) experimentelle Protein-Liganden Affinitäten

25 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge25 31 Carboxamide derivative 5-Hydroxy tryptamine receptor L Benzodiazepine derivative Integrin antagonist L Budesonide Glucocorticoid receptor L Flavin mononucleotide Cytochrome b reductase I Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L Cyclic urea HIV protease I Hoechst DNA L Methotrexate Dihydrofolate reductase I Cyclic-aza isostere HIV protease I Buprenorphine narcotic L Pimozide antipsychoticL Hoechst DNA L Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM Argatroban Thrombin I Peptide derivative Thermolysin I Cyclic-aza isostere HIV protease I Benzodiazepines Integrin L Cyclic urea HIV protease I Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM Cyclic-aza isostere HIV protease I Benzodiazepines IntegrinL Hydroxypyrone HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Benzodiazepines Integrin L Cyclic sulfone HIV protease I Benzodiazepines Integrin L Cyclic-aza isostere HIV protease I Hydroxy pyrone HIV protease I # Atome Ligand Target Typ -log K 1 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999) experimentelle Protein-Liganden Affinitäten

26 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge26 41 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM Cyclic urea HIV protease I Cyclic sulfone HIV protease I Hydroxypyrone HIV protease I Cyclic urea HIV proteaseI Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM Cyclic urea HIV protease I Cyclic sulfone HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Zaragozic acid A Squalene synthase I Cyclic urea HIV proteaseI Cyclic urea HIV protease I Hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I Zaragozic acid B Squalene synthase I Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I Peptide-based Thrombin receptor L Cyclic urea HIV protease I Peptide-based Thrombin receptor L Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Acetyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I Peptide-based Thrombin receptor L Stearyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I 8.89 # Atome Ligand Target Typ log K 1 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999) experimentelle Protein-Liganden Affinitäten

27 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge27 Bindungsaffinität Metallionen oder Metalloenzyme kleine Anionen natürliche Liganden Enzyminhibitoren linearer Anstieg der freien Bindungsenthalpie zu Beginn bis ca. 15 Nicht-H-Atome G binding = - 60 kJ mol -1 maximal. Dann wird Sättigung beobachtet. Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

28 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge28 Interpretation Metallionen und Anionen binden am stärksten. Nanomolekulare Liganden können bereits mit 7-10 Atomen erreicht werden. Grössere Liganden - besitzen üblicherweise nur eine kleine Zahl polarer Atome pro Molekül - die elektrostatischen Gruppen der Bindungsstelle werden zunehmend im Inneren begraben - sind oft elektrisch neutral - besitzen mehr entropische Freiheitsgrade Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999) - G pro Atom

29 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge29 Wie kann man die Bindungsaffinität verbessern? Es gibt 2 Strategien zum Design von stark bindenden Inhibitoren: (a) kombinatorische Strategien (b) rationale Strategien. Beide Strategien erlauben es in der Praxis effizient Lead-Moleküle mit geringer Affinität zu finden; beide sind ineffizient und unzuverlässig, Liganden mit hoher Affinität zu finden (nM). Anwendung der kombinierten Strategie CombiSMoG um Ligand für menschliche Carbonic Anhydrase II (HCA) zu finden. Resultat: Es wurde der stärkste bisher bekannte Ligand für HCA gefunden ( K d = 30 pM). Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)

30 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge30 CombiSMoG Analyse von 1000 Protein-Liganden Komplexe in PDB entwickle statistisches Potential zwischen Atomen des Liganden und des Proteins Kontakt ja, wenn Distanz < 5 Å Vorteile gegenüber Molekülmechanik-Kraftfeldern: (1) sehr schnell auszuwerten (2) Potentialwerte beinhalten implizit die Entropie für Wasserdesolvatation, entsprechen freien Bindungsenthalpien (3) Potential ist typisch für Protein-Liganden-Wechselwirkungen Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)

31 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge31 CombiSMoG-Algorithmus Dunkelgrünes Fragment wird in Bindungstasche positioniert. Weiteres Fragment aus einer Bibliothek mit 100 organischen Substanzen (blau) wird angefügt. Winkel wird in 60° Schritten optimiert. Fragment wird akzeptiert, wenn neuer Gesamt-Score besser als der alte ist bzw. entsprechend einer Monte-Carlo- Zufallsentscheidung. Die Suche nach weiteren Fragmenten wird fortgesetzt bis Abbruchbedinung erreicht wird (z.B. maximale Anzahl an Nicht-H-Atomen erreicht, z.B. 30). Methode kann Strukturen pro Tag generieren.

32 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge32 Strukturen der 5 Liganden mit den besten Scores. In Klammer die Bewertung nach Optimierung mit dem CHARMM- Kraftfeld. Die lila und hellblauen Moleküle wurden synthetisiert und ihre Kristallstruktur mit HCA bestimmt. kombinatorisches Liganden-Design Geeignetes Startfragment mit K D = 120 nM um WW mit Zink-Ion zu vermeiden. (H 2 NO 2 S-Gruppe hat Kontakt mit Zn 2+ ).

33 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge33 Spektakulärer Erfolg für theoretisches Liganden-Design Vorhergesagte Orientierung der R- und S-Stereoisomere In gelb ist jeweils die Kristallstruktur gezeigt. Oben und unten in B sind zwei verschiedene Ansichten gezeigt.

34 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge34 Korrelation von CombiSMoG Scores mit exp. Daten Korrelation für Inhibitoren von HCA,80 Liganden für für die Kristallstrukturen vorliegenasp: Aspartic Protease met: Metalloproteine misc: ser: Serin-Proteasen sug: Zucker-bindende Proteine

35 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge35 Eine konkrete Studie an einem biologischen System – oft kommt es anders als man denkt. Gu, W., Kofler, W., Antes, I., Freund, C., Helms, V. (2005) Biochemistry, 44, Alternative Binding Modes of Proline-rich Peptides Binding to the GYF-Domain.

36 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge36 Why are proline-rich sequences special? Zarrinpar, A., Bhattacharyya, R. P., and Lim, W. A. (2003) The structure and function of proline recognition domains, Sci. STKE. RE8. Repetitive proline-rich sequences are found in many proteins and in many cases are thought to function as docking sites for signaling modules. Why might proline be singled out for recognition by so many key protein-protein interaction modules? Several features of proline distinguish it from the other 19 naturally occurring amino acids (Fig. 1A): - the unusual shape of its pyrrolidine ring - the conformational constraints on its dihedral angles imposed by this cyclic side chain - its resulting secondary structural preferences - its substituted amide nitrogen, - and the relative stability of the cis isomer in a peptide bond. Each recognition domain exploits some combination of these distinctive features of proline in order to achieve specific binding to proline-rich regions.

37 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge37 Properties of PPII helices Zarrinpar, A., Bhattacharyya, R. P., and Lim, W. A. (2003) The structure and function of proline recognition domains, Sci. STKE. RE8. (B) Schematic and structural representation of a PPII helix. The helix has twofold pseudosymmetry: A rotation of 180° about a vertical axis leaves the proline rings and the carbonyl oxygens at approximately the same position. The Protein Data Bank (PDB) accession code for the poly-(l)- proline structure shown is 1CF0. (C) A view down the axis of the PPII helix highlighting the position of the carbons in the xP dipeptide. In the x position that requires C-substitution (blue), the primary recognition element is the β carbon, whereas in the P position that requires N-substitution (red), the primary recognition element is the δ carbon that is unique to proline.

38 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge38 Structure and binding mechanism of SH3 domains Zarrinpar, A. et al. (2003) structure of the Sem5 SH3 domaincartoon of the proline-binding surface in complex with a proline-rich ligand (1SEM).Core recognition surface: yellow: two xP binding grooves formed by aromatic amino acids green: less conserved specificity pockets

39 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge39 Structure and binding mechanism of WW domains 1EG4Core recognition surface: yellow: xP binding groove formed by aromatic amino acids green: less conserved specificity pockets. Zarrinpar, A. et al. (2003)

40 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge40 Structure and binding mechanism of EVH1 domains 1EVH Core recognition surface yellow: conserved set of aromatic residues system is different from other PRS-binding domains Zarrinpar, A. et al. (2003)

41 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge41 Structure and binding mechanism of a GYF domain 1L2ZCore recognition surface: yellow: xP binding groove formed by aromatic amino acids green: less conserved specificity pockets. Zarrinpar, A. et al. (2003)

42 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge42 Identification of a novel register-shifted binding mode Gu et al. Biochemistry, in press (2005) NMR structure of GYF domain with wild- type peptide. The GYF domain is represented by its molecular surface; the peptide atoms are drawn as sticks. Residues forming the binding pocket are coloured in dark grey and labelled by their one-letter codes and sequence numbers.

43 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge43 What is the conformation of the unbound peptide Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

44 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge44 Study conformation of unbound peptide Gu et al. Biochemistry, in press (2005) Evolution of the backbone dihedral angles (black: Phi angles; red: Psi angles) during the MD simulation of the wild-type peptide (a) and the mutant peptide (b). Ideal values of the dihedral angles are shown in solid lines (blue: Phi angles; green: Psi angles).

45 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge45 Unbound peptides have PPII helical conformation Gu et al. Biochemistry, in press (2005) Superposition of the representative conformations of simulations of unbound peptides (from left to right: WT, WTE, G8W and H9M) onto the bound peptide in the NMR structure. Representative conformations are colored in black while the bound peptide in the NMR structure is shown in grey.

46 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge46 Which residues are crucial for binding? Gu et al. Biochemistry, in press (2005) Substitution analysis of the SHRPPPPGHR peptide binding to the GYF domain. All single substitution analogues of the peptide were synthesized on a cellulose membrane. The single letter code above each column marks the amino acid that replaces the corresponding wild-type residue, while the row defines the position of the substitution within the peptide. Spots in the most left column (WT) have identical sequences and represent the wild type peptide. The membrane was incubated with a GST-GYF construct of CD2BP2. Bound protein was detected with an anti-GST primary antibody and a horse-radish peroxidase coupled secondary antibody. The relative spot intensities correlate qualitatively with the binding affinities Conclusion: Two central prolines are critical and the following glycine. But can this glycine be mutated to Trp?

47 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge47 Binding analysis of Trp-peptide mutant Gu et al. Biochemistry, in press (2005) Binding analysis of the CD2BP2-GYF domain to the peptide SHRPPPPWHRV in comparison to the wild-type peptide SHRPPPPGHRV by NMR. (a) The sum of the weighted geometrical differences of the chemical shifts (Geometric sum of chemical shift changes) for assigned peaks, which could be identified at all applied peptide concentrations is plotted against the concentration of the peptide. (b) Mapping of the binding site of SHRPPPPGHRV and SHRPPPPWHRV peptides onto the CD2BP2- GYF domain. Overlay of HSQC spectra of GYF domain alone (green) and GYF-domain in the presence of a 10-fold excess of the wild-type peptide SHRPPPPGHRV (blue) or the mutant peptide SHRPPPPWHRV (red), respectively.

48 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge48 MD simulation of GYF:domain complexes Gu et al. Biochemistry, in press (2005) Comparison of the binding interfaces of the GYF domain (NMR and simulation) for the wild-type complex (above) and of the H9M mutant (below). The GYF domain is represented by its molecular surface and coloured by position (from orange to deep blue: completely buried to completely exposed); the peptide atoms are drawn as sticks and coloured according to their appearance in sequence.

49 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge49 Trp-peptide mutant shows register shift Gu et al. Biochemistry, in press (2005) (a) Superposition of the two binding modes found in the simulation of the G8W mutant complex (starting from the docking results). The two conformations of the peptide are drawn as sticks (blue: mode 1, red: mode 2, pink: Pro6 and Pro7 in mode 1, yellow: Pro6 and Pro7 in mode 2). (b) Binding mode of the G8R mutant complex (representative conformation of the simulation). The peptide atoms are represented by sticks and coloured according to their sequence number. In (a) and (b), the GYF domain is represented by its molecular surface and coloured by position (from orange to deep blue: completely buried to completely exposed) and Pro6 and Pro7 are labelled by their one-letter codes and sequence numbers. Mode 2 is labelled as (alt). (c) Superposition of the representative conformations of the five simulations of wild type GYF complex starting from the alternative binding mode. Pro6 and Pro7 are represented by sticks and are labelled by their one-letter codes and sequence numbers. Pro6 is coloured in light grey and Pro7 is coloured in dark grey. (d) The translation and rotation motions of the peptide between the two binding modes (blue: mode 1, red: mode 2, pink: Pro4 to Pro7 in mode 1, yellow: Pro4 to Pro7 in mode 2). For Pro4 to Pro7 a rotation is the principle component of motion, while for other residues in the peptide a translation is the principle component of motion.

50 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge50 register-shift hypothesis supported by experiments Gu et al. Biochemistry, in press (2005) Substitution analysis of the SHRPPPPWHR peptide binding to the GYF domain. All single substitution analogues of the peptide were synthesized on a cellulose membrane. The single letter code above each column marks the amino acid that replaces the corresponding wild-type residue, while the row defines the position of the substitution within the peptide. Spots in the most left column (WT) have identical sequences and represent the wild type peptide. The membrane was incubated with a GST-GYF construct of CD2BP2. Bound protein was detected with an anti-GST primary antibody and a horse-radish peroxidase coupled secondary antibody. The relative spot intensities correlate qualitatively with the binding affinities

51 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge51 Summary - Complexes of adaptor domains with proline rich sequences form an important cellular network - Specificity of interactions vs. Multiplicity of interactions. - Interactions can be influenced by proline conformation (cis/trans) - Binding modes may not correspond to simple rigid body docking (see register shift)

52 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge52 Zusammenfassung Die Protein:Liganden Wechselwirkung ist heutzutage relativ gut verstanden. Wir haben Tools kennengelernt, mit denen man - die Position des aktiven Zentrums lokalisieren kann - Bindungsaffinitäten abschätzen bzw. verbessern kann - die Assoziation bzw. Dissoziation des Liganden simulieren kann. Für die Zukunft bleibt: (1) korrelierte Analysen aus der umgekehrten Richtung: finde einen Liganden, der selektiv an ein bestimmtes Protein bindet, jedoch nicht an andere (2) Automatisierung + Verknüpfung der obigen Schritte (3) Einbeziehung zusätzlicher Gesichtspunkte (ADMET)

53 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge53 zusätzliche Folien (nicht benutzt)

54 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge54 Welche Aminosäuren bestimmen Substratspezifität? Phosphorylierung ist zentraler Bestandteil vieler Signaltransduktionsketten. Proteinkinasen katalysieren Phosphoryltransfer. - ca. 2% von eukaryotischen Genomen kodieren für Proteinkinasen. - Im Mensch gibt es wohl 518 verschiedene Proteinkinasen. Wie kann hohe Substratspezifität erreicht werden? (a) Lokalisation in unterschiedlichen Zellkompartments, (b) selektive Aktivierung durch Kofaktoren (z.B. CDK) (c) Spezifität des aktiven Zentrums bzw. von Substratbindungspositionen für Bindung bestimmter Liganden Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

55 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge55 prokaryotisches Zweikomponentensystem rot und cyan: 2 katalytische Proteinkinase-Untereinheiten Dimerisierung via Helices PO 4 –Gruppe wird zunächst von ATP auf konserviertes His in Dimerisierungs-Domäne übertragen blau und magenta: Regulatorprotein. Transfer der PO 4 –Gruppe auf Asp Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

56 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge56 Spezifizität bestimmende Residuen MSA : Gruppierung nach Proteinfamilien HK1, HK2, HK3, die jeweils die gleichen Substrate besitzen. Welche Residuen machen die Unterschiede aus? Das konservierte Arg (lila) ist keine spezifitätbestimmende Residue, die roten und blauen Spalten sind dagegen gute Kandidaten. Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

57 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge57 Eukaryotische Proteinkinase gelbes Substratpeptid liegt zwischen den beiden Domänen (rot und blau) der Protein- kinase. In (b) – (d) sind die möglichen spezifitätsbestimmenden Residuen als raumfüllende Modelle gezeigt. Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003) Phospho-Thr197

58 8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge58 Numerische Analyse Definiere Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003) iPosition im Alignment xAminosäuretyp yNummer der Familie in einem Alignment P i (x,y)ist Wahrscheinlichkeit, Aminosäure vom Typ x an Position i in der Familie y zu finden. P i (x) ist die gleiche Wkt, wobei der Typ der Famile egal ist P(y) ist der Anteil aller Proteine, der zu Familie y gehört. I IiIi


Herunterladen ppt "8. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge1 V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung – anschaulich betrachtet Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das."

Ähnliche Präsentationen


Google-Anzeigen