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8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge1 V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das aktive Zentrum? (Docking.

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1 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge1 V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das aktive Zentrum? (Docking wird hier nicht behandelt – siehe Spezialvorlesungen von A. Kämper und A. Hildebrandt/D. Neumann im SS05) Wie stark binden Liganden an Proteine? Wie kann man die Affinität des Liganden verbessern? Wie gelangen Liganden zum Protein (elektrostatische Anziehung)? Wie gelangen sie ins Proteininnere bzw. wieder hinaus?

2 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge2 beta-Trypsin:Benzamidin (3ptb) Enge, sehr polare Bindungstasche auf Proteinoberfläche. Amidin-Gruppen des Liganden bilden 4 H- Bindungen mit Carboxylgruppen des Proteins (Trypsin) aus. Benzolring passt optimal in hydro- phobe Tasche.

3 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge3 Cytochrome P450cam : Kampher (2cpp) Weites, recht unpolares aktives Zentrum im Proteininneren. Hämgruppe katalysiert Reaktion. Partielle Desolvatation. Wie gelangt Substrat hinein?

4 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge4 Maus-Antikörper McPC-603:Phosphocholine (2mcp) Bindungstasche auf Proteinoberfläche wird durch drei hypervariable Loops geformt.

5 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge5 Streptavidin:Biotin (1stp) Sehr polare, tiefe Bindungstasche. Außerordentlich starke Affinität.

6 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge6 HIV-1 Protease:XK-263 Inhibitor (1hvr) Inhibitor XK-263 stammt von Merck-Dupont. Er enthält eine 7-Ring zyklische Urea-Einheit mit Phenyl- und Naphtyl-Ringen. Die CO-Gruppe ahmt das ansonsten konservierte Wassermolekül 301 nach und verdrängt es. Der tiefere Teil des zyklischen Urea-Rings enthält zwei benachbarte Hydroxylgruppen, die H-Bindungen mit den katalytischen Aspartat-Residuen bilden.

7 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge7 Identifikation von funktionellen Residuen 1 Funktionelle bzw. katalytische Residuen werden traditionell in (hoch) konservierten Regionen von Multiple Sequence Alignments erwartet evtl. Kopplung mit Information über 3D-Struktur 2: finde Residuen, die Proteinstruktur destabilisieren. Grund: Funktionelle Residuen im Proteininneren sind oft energetisch ungünstig. Funktionalität auf Kosten von Stabilität. 3: finde Löcher oder Einbuchtungen in Proteinstruktur. Hier vorgestellt: integrierte Methode, die 1 -3 implementiert. Möglichkeit für funktionelle Annotation von Proteinen mit unbekannter Funktion.

8 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge8 Wo ist das aktive Zentrum I? Auswahl von 49 Enzymen. Kriterien: - Auflösung 2.0 Å - funktionelle Residuen sind bekannt (in Swissprot-Eintrag in ACT_SITE) - enthalten nur eine Domäne (SCOP Datenbank) - die SCOP-Einträge sind unterschiedlich - es gibt 10 homologe Sequenzen mit Blast E-Wert < katalytische Residuen: 22 His 17 Asp, Glu 10 Cys 8 Ser 7 Arg, Lys Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003) 5 Tyr 3 Asn 2 Thr

9 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge9 Repräsentative Enzyme PDBProtein Länge Auflösung EC Zahl Zahl und Namen der SCOP Seq. katalytischen Residuen

10 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge10 Repräsentative Enzyme

11 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge11 Fitness-Funktion - Bewertung der Seitenketten-Konformation entsprechend Rotamer-Bibliothek - Seitenketten-Packung (wissensbasiert) - Hydratation (wissensbasiert) - Analyse der Proteinoberfläche (MSP-Programm): Zuordnung zu den einzelnen Residuen - elektrostatische Energie: AMBER-Partialladungen elektrostatisches Potential (aus Poisson-Boltzmann-Rechnung) Jeder Score(S), Rang (R) und Position (L) werden gegen den Mittelwert und die Standardabweichung für jeden Aminosäuretyp normalisiert. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

12 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge12 Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Beispiel: 3D-Profil für Lysozym aus Hühnereiweiss. D52 ist katal. Residue. native Hydratations- lokaleD52 hat sehr schlechten Rang. D.h. Residue klasse Struktures wäre günstig D52 zu ersetzen. Katalytische Residuen sind stets un- stabiler als nicht-katalytische. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003) Score Rang Score native native beste Residue Residue Residue

13 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge13 Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Flussdiagramm der Vorhersagemethode. - Links oben Analyse der Konservierung. - Rechts oben Analyse der Position in 3D-Struktur bzw. Stabilität der Mutantenproteine - untere Hälfte trifft für verschiedene Aminosäuretypen (1-Letter-code) die Entscheidung, ob katalytische Residuen vorliegen. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

14 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge14 Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003) Proteinstrukturen mit unbekannter Funktion. Die vorgeschlagenen katalytischen Residuen sind markiert.

15 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge15 Wo ist das aktive Zentrum II Analyse mit elektrostatischen Kontinuumsrechnungen Die Titrationszustände der meisten Aminosäuren folgen der Henderson-Hasselbalch-Gleichung. Berechne Titrationskurven für 3 Enzyme mit UHBD. TIM und AR haben eine sehr ähnliche Strukturen, katalysieren aber ganz unterschiedliche Reaktionen. AR und PMI haben sehr verschiedene Strukturen, katalysieren aber ähnliche Reaktionen. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

16 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge16 Theoretische Titrationskurven Titrationskurven aller His-Residuen in TIM Triosephosphat Isomerase (TIM) katalysiert die Isomerierung von D-Glyceraldehyd- 3-Phosphat zu Dihydroxyaceton-Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: His95, Glu165, Lys112, Tyr164. Davon liegen H95, E165 und Y164 eng beieinander. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

17 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge17 Titrationskurven aller Tyr-Residuen in AR Theoretische Titrationskurven Aldose-Reduktase (AR) katalysiert die Reduktion einer Aldehydgruppe von Aldose zu einem Alkohol. Man findet 7 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: Tyr48, Cys298, Glu185, Lys21, Lys77, Tyr107, Tyr209. Tyr48, His110 und Cys298 bilden das aktive Zentrum. Die anderen Residuen liegen in der Nähe. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

18 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge18 Titrationskurven aller Lys-Residuen in PMI Theoretische Titrationskurven PMI katalysiert die Interkonversion von Mannose-6-Phosphat und Fructose-6- Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: His135, Lys100, Lys136, Tyr287. Alle liegen eng beieinander, die ersten 3 wohl im aktiven Zentrum und His135 nahe bei Lys136. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

19 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge19 Weitere Beispiele PDB ID Name ChemieResiduen mit auffälligen Titrationskurven 1AMQ Aspartat [H189, Y225, K258, R266, C191, C192], aminotransferase * Transamination [Y256], [Y295], [H301] * 1CSE1CSE Subtilisin Peptidhydrolyse [D32, H64] Carlsberg (Serin-Protease) 1EA51EA5 Acetylcholinesterase Ester Hydrolyse [Y130, E199, E327, H440, D392], [Y148], [H398], [H425] 1HKA1HKA 6-Hydroxymethyl- * Kinase [D97, H115] * 7,8-dihydropterin pyrophosphate kinase 1OPY1OPY 3-Keto- 5 -Steroid Isomerase[Y16, Y32, Y57], [C81] isomerase 1PIP1PIP Papain Peptidhydrolyse [C25, H159], (Cys Protease) [K17, K174, Y186], [R59], [R96] 1PSO1PSO Pepsin Peptidhydrolyse [D32, D215, D303], [D11] (Säure-Protease) 1WBA1WBA Winged bean Speicherung - keine keine albuminEnzymfunktion Residue im zweiter Schale. Residue im aktiven Zentrum Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

20 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge20 Fazit Mittels elektrostatischer Kontinuumsrechnungen für bekannte Kristallstrukturen von Proteinen wurde für verschiedene externe pH-Werte die energetisch optimale Gesamtladung der Proteine berechnet. Aktive Zentren von Enzymen enthalten oft mehrere polare bzw. geladene Seitenketten um die chemische Umwandlung zu katalysieren. Deren Titrationszustände sind eng aneinander gekoppelt und zeigen im Vergleich zu isolierten Seitenketten sehr ungewöhnliche Titrationskurven. Diese Methode erlaubt also die Position von aktiven Zentren allein aufgrund der Proteinstruktur zu erkennen. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, (2001)

21 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge21 Wie stark binden Liganden an Proteine? Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

22 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge22 exp. Affinitäten von Protein:Liganden Komplexen # Atome Ligand Target Typ -log K 1 1 Ca 2+ Amino-transferase IM 6.70IM: Metallionischer Inhibitor 1 Hg 2+ Uroporphy-synthase IM Mn 2+ Inositol-phosphataseIM Fe 3+ Hydroxylase IM Ag + Arylformamidase IM F - Phosphotransferase IA 4.55IA: kleiner anionischer Inhibitor 1 S 2- Peroxidase IA Xe Myoglobin L 2.30L: Ligand (Agonist oder Antagonist) 1 NH 3 Meamine glutamate transferase I 1.79 I: Inhibitor 2 COMyoglobin L O 2 Myoglobin L Cyanide Methane oxygenase IA Hydroxylamine Glycerol oxidase IC 5.92 IC: potentiell kovalente Wechselwirkung 3 Azide Glycerol oxidase IA Ethylamine Protease II Thioacetamide Methan monooxygenase I NO 3 - Carbonate deydratase IA Vanadate Phytase IA Thiosemicarbazide Methane monooxygen. I SO 4 2- Creatine kinase IA Iodoacetamide Methyl transferase IC Putrescine Spermine synthase I Aminooxyacetic acid Aminotransferase I Oxalat Lactate dehydrogenase IA Aminobutyid acid Neuromanidase transmitter L L-Cysteine Serine acetyl transferase I Aminomethiozolidine Methyl transferase I Muscimol -aminobutylicacid agonist L Bromopyrimidone Cytosine deaminase I Phosphonoacetic acid DNA polymerase I Acetopyruvate Acetoacetate decarboxylase I Methyl iodotyrosine Tyrosine monooxygenase I Nitrooxazolidinone Aldehyde dehydrogenase I Benzamidine Trypsin I 4.77

23 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge23 experimentelle Protein-Liganden Affinitäten 10 Allopurinol Xanthine oxidase I Acetylcholine Cholinergic receptor L Cabachol Cholinergic receptor L Mercapto oxoglutaric Isocitrate dehydrogenase I Diethyl pyrocarbonate Ca2+ transmitter L Dopamine,, -androgen receptor L Norepinephrine Adrenergic agonist L Nicotine Nicotinic receptor L Hydroxybenzyl-Me3NR4 Acetycholiesterase I I Tiamenidine -Adrenergic agonist L Serotonin 5-Hydroxy tryptamine receptor L Benzyl mercaptopropionate Carboxypeptidase I Guanabenz -Adrenergic receptor L Methylenpenicillanic -Lactamase I Captopril Carboxypeptidase I Aminoclonidine L Guanfacine -Adrenergic agonist L Isatin derivative Rhino protease I Acetophenone derivativeACEsterase IC Biotin Streptavidin L Naphazoline Adrenergic L Melatonin Melatonin receptor L Guanine derivative Purine nucleoside phosphorylase I piperoxan antihyper. receptor L Iodomelatonin Melanin receptor L Alprenolol -adrenergic receptor L Phosphoramidon Metalloproteinase I Vesamicol Vesamicol receptor L Propranolol -adrenergic receptor L Trimethopri der Dihydrofolate reductase I Estradiol Steroid receptor L Melatonin derivative Melatonin receptor L Vesamicol derivative Vesamicol receptor L Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I Triprolidine Histamine antagonist L Trimethoprim dihydrofolate reductase I 8.44 # Atome Ligand Target Typ -log K 1 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

24 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge24 22 Amitriptylinoxide Antidepressant L Mazindol derivative Dopamine transporter L Indolyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L Isatin derivative Rhino protease I Vesamicol der. VR L Neuraminic acid der. Sialidase I Melatonin der. melamin receptor L Vesamicol der. VR L Vesamicol der. VR L Isatin der. Rhino protease I Methadone Narcotic L Melatonin der. Melamin receptor L Corticosterone Steroid receptor L Isatin der. Rhino protease I Aldosterone Steroid receptor L Haloperidol Antipsychotic L Yohimbine -2 adrenergic receptor L Isatin der. Rhino protease I Vesamicol der. VR L Dexetimide Anticholinergic L Dehydrosinefungin mRNA Me trans. I Vesamicol der. VR L Indoyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L Prazosin 1-adrenergic agonist L Spiperone L Ketanserin Serotonin antagonist L Dextromoramide Analgesic L Peptide phosphonates Carboxy peptidase IM Domperidone Dopamine antagonist L Etorphine Narcotic L 9.91 # Atome Ligand Target Typ -log K 1 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999) experimentelle Protein-Liganden Affinitäten

25 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge25 31 Carboxamide derivative 5-Hydroxy tryptamine receptor L Benzodiazepine derivative Integrin antagonist L Budesonide Glucocorticoid receptor L Flavin mononucleotide Cytochrome b reductase I Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L Cyclic urea HIV protease I Hoechst DNA L Methotrexate Dihydrofolate reductase I Cyclic-aza isostere HIV protease I Buprenorphine narcotic L Pimozide antipsychoticL Hoechst DNA L Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM Argatroban Thrombin I Peptide derivative Thermolysin I Cyclic-aza isostere HIV protease I Benzodiazepines Integrin L Cyclic urea HIV protease I Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM Cyclic-aza isostere HIV protease I Benzodiazepines IntegrinL Hydroxypyrone HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Benzodiazepines Integrin L Cyclic sulfone HIV protease I Benzodiazepines Integrin L Cyclic-aza isostere HIV protease I Hydroxy pyrone HIV protease I # Atome Ligand Target Typ -log K 1 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999) experimentelle Protein-Liganden Affinitäten

26 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge26 41 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM Cyclic urea HIV protease I Cyclic sulfone HIV protease I Hydroxypyrone HIV protease I Cyclic urea HIV proteaseI Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM Cyclic urea HIV protease I Cyclic sulfone HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Zaragozic acid A Squalene synthase I Cyclic urea HIV proteaseI Cyclic urea HIV protease I Hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I Zaragozic acid B Squalene synthase I Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I Peptide-based Thrombin receptor L Cyclic urea HIV protease I Peptide-based Thrombin receptor L Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Cyclic urea HIV protease I Acetyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I Peptide-based Thrombin receptor L Stearyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I 8.89 # Atome Ligand Target Typ log K 1 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999) experimentelle Protein-Liganden Affinitäten

27 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge27 Bindungsaffinität Metallionen oder Metalloenzyme kleine Anionen natürliche Liganden Enzyminhibitoren linearer Anstieg der freien Bindungsenthalpie zu Beginn bis ca. 15 Nicht-H-Atome G binding = - 60 kJ mol -1 maximal. Dann wird Sättigung beobachtet. Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

28 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge28 Interpretation Metallionen und Anionen binden am stärksten. Nanomolekulare Liganden können bereits mit 7-10 Atomen erreicht werden. Grössere Liganden - besitzen üblicherweise nur eine kleine Zahl polarer Atome pro Molekül - die elektrostatischen Gruppen der Bindungsstelle werden zunehmend im Inneren begraben - sind oft elektrisch neutral - besitzen mehr entropische Freiheitsgrade Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999) - G pro Atom

29 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge29 Wie kann man die Bindungsaffinität verbessern? Es gibt 2 Strategien zum Design von stark bindenden Inhibitoren: (a) kombinatorische Strategien (b) rationale Strategien. Beide Strategien erlauben es in der Praxis effizient Lead-Moleküle mit geringer Affinität zu finden; beide sind ineffizient und unzuverlässig, Liganden mit hoher Affinität zu finden (nM). Anwendung der kombinierten Strategie CombiSMoG um Ligand für menschliche Carbonic Anhydrase II (HCA) zu finden. Resultat: Es wurde der stärkste bisher bekannte Ligand für HCA gefunden ( K d = 30 pM). Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)

30 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge30 CombiSMoG Analyse von 1000 Protein-Liganden Komplexe in PDB entwickle statistisches Potential zwischen Atomen des Liganden und des Proteins Kontakt ja, wenn Distanz < 5 Å Vorteile gegenüber Molekülmechanik-Kraftfeldern: (1) sehr schnell auszuwerten (2) Potentialwerte beinhalten implizit die Entropie für Wasserdesolvatation, entsprechen freien Bindungsenthalpien (3) Potential ist typisch für Protein-Liganden-Wechselwirkungen Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)

31 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge31 CombiSMoG-Algorithmus Dunkelgrünes Fragment wird in Bindungstasche positioniert. Weiteres Fragment aus einer Bibliothek mit 100 organischen Substanzen (blau) wird angefügt. Winkel wird in 60° Schritten optimiert. Fragment wird akzeptiert, wenn neuer Gesamt-Score besser als der alte ist bzw. entsprechend einer Monte-Carlo- Zufallsentscheidung. Die Suche nach weiteren Fragmenten wird fortgesetzt bis Abbruchbedinung erreicht wird (z.B. maximale Anzahl an Nicht-H-Atomen erreicht, z.B. 30). Methode kann Strukturen pro Tag generieren.

32 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge32 Strukturen der 5 Liganden mit den besten Scores. In Klammer die Bewertung nach Optimierung mit dem CHARMM- Kraftfeld. Die lila und hellblauen Moleküle wurden synthetisiert und ihre Kristallstruktur mit HCA bestimmt. kombinatorisches Liganden-Design Geeignetes Startfragment mit K D = 120 nM um WW mit Zink-Ion zu vermeiden. (H 2 NO 2 S-Gruppe hat Kontakt mit Zn 2+ ).

33 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge33 Spektakulärer Erfolg für theoretisches Liganden-Design Vorhergesagte Orientierung der R- und S-Stereoisomere In gelb ist jeweils die Kristallstruktur gezeigt. Oben und unten in B sind zwei verschiedene Ansichten gezeigt.

34 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge34 Korrelation von CombiSMoG Scores mit exp. Daten Korrelation für Inhibitoren von HCA,80 Liganden für für die Kristallstrukturen vorliegenasp: Aspartic Protease met: Metalloproteine misc: ser: Serin-Proteasen sug: Zucker-bindende Proteine

35 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge35 Welche Aminosäuren bestimmen Substratspezifität? Phosphorylierung ist zentraler Bestandteil vieler Signaltransduktionsketten. Proteinkinasen katalysieren Phosphoryltransfer. - ca. 2% von eukaryotischen Genomen kodieren für Proteinkinasen. - Im Mensch gibt es wohl 518 verschiedene Proteinkinasen. Wie kann hohe Substratspezifität erreicht werden? (a) Lokalisation in unterschiedlichen Zellkompartments, (b) selektive Aktivierung durch Kofaktoren (z.B. CDK) (c) Spezifität des aktiven Zentrums bzw. von Substratbindungspositionen für Bindung bestimmter Liganden Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

36 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge36 prokaryotisches Zweikomponentensystem rot und cyan: 2 katalytische Proteinkinase-Untereinheiten Dimerisierung via Helices PO 4 –Gruppe wird zunächst von ATP auf konserviertes His in Dimerisierungs-Domäne übertragen blau und magenta: Regulatorprotein. Transfer der PO 4 –Gruppe auf Asp Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

37 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge37 Spezifizität bestimmende Residuen MSA : Gruppierung nach Proteinfamilien HK1, HK2, HK3, die jeweils die gleichen Substrate besitzen. Welche Residuen machen die Unterschiede aus? Das konservierte Arg (lila) ist keine spezifitätbestimmende Residue, die roten und blauen Spalten sind dagegen gute Kandidaten. Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

38 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge38 Eukaryotische Proteinkinase gelbes Substratpeptid liegt zwischen den beiden Domänen (rot und blau) der Protein- kinase. In (b) – (d) sind die möglichen spezifitätsbestimmenden Residuen als raumfüllende Modelle gezeigt. Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003) Phospho-Thr197

39 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge39 Numerische Analyse Definiere Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003) iPosition im Alignment xAminosäuretyp yNummer der Familie in einem Alignment P i (x,y)ist Wahrscheinlichkeit, Aminosäure vom Typ x an Position i in der Familie y zu finden. P i (x) ist die gleiche Wkt, wobei der Typ der Famile egal ist P(y) ist der Anteil aller Proteine, der zu Familie y gehört. I IiIi

40 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge40 Wie gelangen Liganden zum bzw. ins Protein?

41 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge41 Elektrostatische Ausrichtung Manche Proteine müssen Liganden mit starker Netto- ladung bzw. Dipolmoment anziehen. Sie erzeugen (durch geladene Aminosäuren auf ihrer Ober- fläche) ein starkes anziehendes elektrostatisches Potential. Dann wird die kinetische Zeitkonstante k on sehr schnell und das Enzym arbeitet oft am diffusions-limitierten Optimum.

42 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge42 Electrostatic Steering Wade et al. PNAS 95, 5942 (1998) TIM Superoxid Dismutase beta-Lactamase el. Potential Isopotential- flächen Ähnlichkeit des elektrostatischen Potentials bei verschiedenen Mitgliedern der Proteinfamilie bei hinreichender Sequenzidentität ist das erzeugte elektrostatische Potential oft sehr ähnlich.

43 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge43 Transport zwischen 2 Bindungstaschen Multiproteinkomplexe ermöglichen substrate channeling zwischen mehreren aktiven Zentren. Ligand diffundiert auf Proteinoberfläche. Dieser Transportmechanismus ist besonders effizient, da ungerichtete, freie Diffusion vermieden wird.

44 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge44 Wie gelangen Liganden ins Proteininnere bzw. wieder heraus? Die Bindung von Liganden im Proteininneren hat die Effekte, - eine Umgebung mit unterschiedlicher (kleinerer) Dielektrizitätskonstante zu schaffen, in der die Elektrostatik eine grössere Rolle spielt, - den Liganden in ein polarisiertes Umfeld zu bringen, das den Übergangs- zustand einer chemischen Reaktion stabilisiert (A. Warshel) - die Reaktion von eventuell störenden Wassermolekülen zu separieren, die zu chemischen Nebenreaktionen führen könnten. Deshalb erfordern manche Proteine (Tryptophan Synthase, Acetylcholinesterase, Cytochrom P450), dass die Liganden durch transient offene Kanäle ins Proteininnere transportiert werden. Zur Betrachtung der Ligandenaffinität gehört demnach auch die Analyse der Pfade ins bzw. aus dem Protein heraus.

45 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge45 AchE: Konformationelle Kontrolle des Eintrittskanals

46 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge46 AchE: Konformationelle Kontrolle des Eintrittskanals dynamische Kontrolle der Grösse des Eintrittskanals in Acetylcholinesterase durch zwei aromatische Residuen (lila)

47 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge47 Cytochrom P450: mögliche Austrittspfade der Liganden Cytochrom P450camBM-3eryF Substrat Kampher:negativ geladene6-deoxyerythronolide B kompakt, hydrophobFettsäuren Moleküldynamiksimulationen wurden von gebundenem Zustand gestartet, zufällige Kicks wirken auf den Liganden, damit der Austritt aus dem Protein beschleunigt wird. Winn et al. PNAS 99, 5361 (2002)

48 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge48 Cytochrom P450: mögliche Austrittspfade der Liganden Kristallstrukturen Konformation nach Ligandenaustritt (Simulation) Ligandenaustritt erfordertgrössere transientedynamische Kontrolle kleine Änderungen desÄnderungen desder Kanalöffnung Rückgrats, Rotation vonProteinrückgratsdurch Arg185 aromatischen Seitenketten Mechanismus der Protein-Öffnung ist an physikochemische Eigenschaften des jeweiligen Substrats angepasst. Winn et al. PNAS 99, 5361 (2002)

49 8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge49 Zusammenfassung Die Protein:Liganden Wechselwirkung ist heutzutage relativ gut verstanden. Wir haben Tools kennengelernt, mit denen man - die Position des aktiven Zentrums lokalisieren kann - Bindungsaffinitäten abschätzen bzw. verbessern kann - die Assoziation bzw. Dissoziation des Liganden simulieren kann. Für die Zukunft bleibt: (1) korrelierte Analysen aus der umgekehrten Richtung: finde einen Liganden, der selektiv an ein bestimmtes Protein bindet, jedoch nicht an andere (2) Automatisierung + Verknüpfung der obigen Schritte (3) Einbeziehung zusätzlicher Gesichtspunkte (ADMET)


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