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Einzelmolekülspektroskopie an lebenden Zellen Vortrag für das physikalische Hauptseminar von Ulrich Stopper, Januar 2004.

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1 Einzelmolekülspektroskopie an lebenden Zellen Vortrag für das physikalische Hauptseminar von Ulrich Stopper, Januar 2004

2 Vorteile der Untersuchung einzelner Moleküle: Quantitativer Einblick in biologische Prozesse Arbeit mit niedrigen Stoffkonzentrationen natürliche Vorgänge in der Zelle werden nicht gestört Schwierigkeiten bei der Untersuchung einzelner Moleküle: empfindliche Detektoren hohe Zeitauflösung Photobleichen Photobleichen: Bei langer Laserbestrahlung, Übergang des Fluorophors in einen Zustand, der keine optische Relaxation erlaubt.

3 Drei Beispiele : 1.) Untersuchung der Endozytose 2.) Erforschung chemotaktischer Zellen 3.) Verfolgung der viralen Infektion

4 1.) Untersuchung endozytoser Prozesse in lebenden Zellen mit der Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Analyse (Bacia et al., MPI für biophysikalische Chemie in Göttingen, 2002)

5 1. Untersuchung der Endozytose Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS): Messung des Fluoreszenzsignals: t F einzelne Fluorophore diffundieren durch den Laserfokus Anwendung der Autokorrelation (i = j) : τ GFGF 1 0 Diffusionszeit der Partikel : zeitliches Mittel τ : zeitliche Verschiebung Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS): Messung zweier Fluoreszenzsignale, von spektral unterscheidbaren Molekülen. Anwendung der Kreuzkorrelation (i j). Anstieg von G ij F (0), wenn zwei unterschiedliche Moleküle aneinander gebunden sind.

6 Experimenteller Aufbau für die FCCS: Zellprobe Objektiv Laseranregung 488nm & 631nm (einige μW) Fokus Hauptstrahlteiler Sekundärstrahlteiler Detektor 1 Detektor 2 lateraler 1/e²-Radius des Beobachtungsvolumens: ~0,18μm für grün, 0,25μm für rot FrFr FgFg 1. Untersuchung der Endozytose

7 Experiment : Bakterielles Cholera-Toxin (CTX) wurde mit Cy2- und Cy5- Farbstoffmolekülen an unterschiedlichen Untereinheiten des Moleküls markiert : Markiert mit Cy5: B 5 -Einheit (verantwortlich für die Bindung an die Zelloberfläche durch Wechselwirkung mit GM1- Gangliosid) Markiert mit Cy2: A-Einheit (enzymatisch aktiv) an eine Zellmembran gebundenes CTX 1. Untersuchung der Endozytose

8 CTX nutzt vermutlich einen Pfad durch das Endoplasma und den Golgi- Apparat aus, den es rückwärts durchläuft, um zum endoplasmatischen Retikulum zu gelangen. Golgi-Apparat endoplasmat. Retikulum Sekretproduktion durch das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat (Exozytose) Aufnahme des Choleratoxins in die Zelle (Endozytose) 1. Untersuchung der Endozytose

9 Wie markiert man ein Biomolekül mit zwei verschiedenen Farbstoffen ? - Cy2-Färbung würde sich nicht nur an A-Einheit, sondern auch an B-Einheit binden Experiment wäre nicht durchführbar Also: B-Einheit muss abgeschirmt werden - Cy5 lagert sich ausschließlich an B-Einheit an. Einsatz von Antikörper gegen die B-Einheit - Einfärben der A-Einheit - Entfernen der Antikörper 1. Untersuchung der Endozytose

10 Beobachtung des doppelt markierten CTX mit FCCS, gleichzeitig LSM-Imaging: - die ersten Sekunden: Keine Kreuzkorrelation (KK) und keine Autokorrelation (AK), LSM: Starkes Photobleichen CTX ist unbeweglich Anbindung an die Membran LSM-Bild der Zelle in den ersten Sekunden Pfeil: Photobleichen durch Korrelations-Messung - Kurz darauf: Nach anfänglichem Photobleichen, Anstieg von AK und KK Erste Vesikel kapseln sich ab und diffundieren durch den Fokus Zellmembran und Membran- nahe Vesikel mit CTX 1. Untersuchung der Endozytose

11 - 15 Min. später: Starke KK in den meisten intrazellulären Messungen B- und A-Einheit sind immer noch an einander gebunden, diffundieren durch das Plasma - einige Minuten danach: Abnahme der KK und der AK, LSM bestätigt Photobleichen Immobilität Vesikel werden vom Golgi-Apparat aufgenommen A- und B-Einheit werden erst im Golgi von einander getrennt ! LSM-Aufnahme des Zytoplasmas nach 15 Minuten AK Cy2 AK Cy5 KK gemessen an der markierten Stelle im linken Bild - Kurz darauf: leicht erhöhte AK, immernoch keine KK A und B wieder beweglich, aber keine gemeinsame Bewegung LSM-Aufnahme des Golgi keine KK im Golgi 1. Untersuchung der Endozytose

12 Diffusionszeiten im Zellplasma können aus Fits an die Korrelationskurven bestimmt werden: τ Diff = 20ms Diffusionskonstante D 6·10 -9 cm 2 /s (langsame Diffusion) Stokes-Einstein-Gleichung: η 5 : Viskosität R h : hydrodynamischer Radius Durchmesser der diffundierenden Partikel: 2R h 150nm bestätigt Einschluß in Vesikel 1. Untersuchung der Endozytose Weiterer Beweis für Vesikelbildung: Anwendung einer Mischung aus unterschiedlich einfach-markiertem CTX (CTX-Cy2 & CTX-Cy5) auf eine Zelle. Starke KK im Zellplasma, obwohl jedes einzelne Molekül nur einfach markiert ist! Mehrere CTX- Moleküle führen korrelierte Bewegungen aus. Bindung in Vesikel AK- und KK-Kurven für unterschiedliche Mischungen

13 Zusammenfassung der Ergebnisse der Korrelations-Analyse von CTX: - FCCS kann verwendet werden, um herauszufinden, ob unterschiedliche Moleküle gebundene Bewegungen ausführen. - A- und B-Einheiten des CTX-Moleküls werden erst nach Erreichen des Golgi-Apparats voneinander getrennt. - Mehrere CTX-Moleküle werden in einzelne Vesikel zusammengeschlossen, die im Plasma diffundieren. 1. Untersuchung der Endozytose

14 2.) Einzelmolekül-Analyse von chemotaktischen Prozessen mit der Totalreflexions-Fluoreszenz-Mikroskopie (Ueda et al., Universität Osaka, 2001)

15 TIRFM (Total internal reflection fluorescence microscopy) : dünnes Medium dichtes Medium evaneszentes elektromagnetisches Feld Intensität Eindringtiefe (einige hundert nm) Totalreflexion Photonen tunneln in das Fluorophor Vorteil: sehr geringe Hintergrundfluoreszenz 2. Erforschung chemotaktischer Zellen Objektiv

16 Dictyostelium-Zellen reagieren chemotaktisch auf cAMP Chemotaxie spielt wichtige Rolle bei: - Immunsystem - Ausbildung neuronaler Netze - Morphogenese der Schleimpilz Dictyostelium discoideum wichtiger Botenstoff, der aus ATP gebildet wird und zur Steuerung von Zellfunktionen dient. zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP): 2. Erforschung chemotaktischer Zellen

17 Aktivierung GDP G-Protein GTP Rezeptor cAMP G-Protein GTP Enzym Umbau des Zellskeletts Die chemotaktische Reaktion wird durch Rezeptoren an der Zelloberfläche und durch G-Protein-abhängige Signalübermittlung ermöglicht: 2. Erforschung chemotaktischer Zellen

18 Experiment: Echtzeit-Abbildung von einfach fluorophorisch markierten cAMP- Molekülen, die an die Oberfläche einer Dictyostelium-Zelle gebunden sind. TIFRM-Bild der Dictyostelium-Zelle vor Abwaschen von un- gebundenem Cy3-cAMP Gleich nach Zugabe des cAMP beginnt dieses, sich an die Membran zu binden und sich lateral zu bewegen. einzelne, fluoreszierende Cy3-cAMP-Moleküle 2. Erforschung chemotaktischer Zellen

19 Verfolgung einzelner Fluoreszenzpunkte über mehrere Minuten: Diffusion einzelner cAMP-Rezeptor-Komplexe letztes Bild: Trajektorien laterale Beweglichkeit mit D = (2,7 ± 1,1) · cm 2 /s meistens sehr lineare Bewegungen mit gelegentlichen Zwischenstopps evtl. Wechselwirkung mit Zellskelett REM-Aufnahme eines Zellskeletts 2. Erforschung chemotaktischer Zellen

20 Zellen bewegen sich linear in Richtung des Gradienten. Erzeugung eines cAMP- Konzentrationsgradienten cAMP-Konzentrationsgradient wird mit einer Mikropipette erzeugt. 2. Erforschung chemotaktischer Zellen Verfolgung der cAMP-Rezeptor-Komplexpositionen: Pfeil: Konzentrationsgradient

21 Die meisten Cy3-Punkte blieben nur einige Sekunden lang an der Membran haften: Punkte, die seit t=0 an der Membran haften Dissoziationsratenunterschied zwischen vorderer und hinterer Hälfte schneller cAMP-Austausch langsamer cAMP-Austausch Konzentrationsgradient und Bewegungsrichtung vordere Hälfte: 12% mehr Rezeptoren als auf der hinteren Hälfte Aber: Kein Unterschied im Diffusionskoeffizienten Es befinden sich auf der Membran im Mittel mehr Rezeptoren an der nach vorne gerichteten Zellhälfte: 2. Erforschung chemotaktischer Zellen

22 Zwei mögliche Ursachen für schnelleren cAMP-Austausch: - Rezeptor-Phosphorylierung oder - besondere Wechselwirkung zwischen G-Protein und Rezeptor Phosphorylierung: Chemische Reaktion (Anhängen einer Phosphatgruppe), die die Rezeptoraffinität um das 3- bis 6-Fache verringert. Wichtige Entdeckung: Dissoziationsratenunterschied zwischen der einen und der anderen Seite der Zelle existiert auch dann, wenn kein Konzentrations- Gradient vorhanden ist ! zellinterne Polarisation legt die Zellvorderseite fest ! selbes Experiment diesmal mit zwei verschiedenen Dictyostelium-Mutationen: 1. Mutation: phosphorylierte Rezeptoren keine Veränderung Phosphorylierung ist nicht die Ursache 2. Mutation: defektes G-Protein keine Dissoziationsunterschiede mehr ! Wahrscheinlich ist G-Protein-Rezeptor-Wechselwirkung die Ursache. 2. Erforschung chemotaktischer Zellen

23 Beobachtung der Auswirkungen bei Zugabe von GTP und GDP: - GTP verursacht Zunahme der cAMP- Dissoziationsrate - GDP hat keinen Effekt G-Protein beeinflusst das Liganden-Bindungsverhalten. Überprüfen, ob Rezeptor - G-Protein - Wechselwirkung vorliegt: cAMP-Austauschgeschwindigkeit ohne (-) und mit (+) Zugabe von GTP. dunkel-/hellgrau/weiß: Zusammensetzung des Fits aus einer schwach/mittel/stark abklingenden Komponente unveränderte Zelle 1. Mutation 2. Mutation (2 Varianten) 2. Erforschung chemotaktischer Zellen Fragen, die noch zu beantworten sind: Ist die Polarisation des Dissoziationsverhaltens eine spezielle Eigenschaft der Membran oder des Zellskeletts? Kann sich die Polarisation, also die Auszeichnung der Vorderseite zeitlich verändern?

24 3.) Echt-Zeit-Aufzeichnung des Infektionsvorgangs eines Adeno-assoziierten Virus mit Single Virus Tracing (Bräuchle et al., LMU München, 2001)

25 Viren werden mit nur ein oder zwei Cy5-Molekülen markiert, um den natürlichen Vorgang nicht zu beeinflussen. sehr hohe Detektorempfindlichkeit notwendig Beobachtung mit der Weitfeldmikroskopie Detaillierte Kenntnisse über virale Infektionsprozesse sind von großer Bedeutung für antivirale Medizin und Gen-Therapie. Adeno-assoziierter Virus 3. Single Virus Tracing Adeno-assoziierter Virus (AAV): kleiner Virus, der den Adenovirus zur Ausbreitung benötigt. Verursacht keine Krankheit beim Menschen interessant für Gen-Therapie

26 Außerhalb der Zelle: normale Diffusion mit D = 7,5 μm 2 /s 3. Single Virus Tracing Häufigkeit n der Trajektorien ohne Penetration mit n Touch Kontakten Fits In der Nähe der Zellmembran: - Beschleunigung in Richtung Zellwand - Wiederholte Berührungsereignisse, unterbrochen von kurzer Diffusion in Zellnähe Im Durchschnitt 4,4 Berührungen

27 mittlere Berührungszeit: 62ms mittlere Kontaktdauer: 3,2s (erster... letzter Kontakt) Häufigkeit n der Trajektorien ohne Penetration mit der mittleren Berührungszeit t Fit Eindringen in die Zelle: mittlere, zum Eindringen benötigte, Kontaktzeit: 1,2s Eindringeffizienz: 13% Membran ist eine wichtige Barriere gegen Viren. Trajektorien mit Penetration: 3. Single Virus Tracing

28 Im Zellplasma: 47% normale Diffusion ( ~ t) D = 0,6 μm 2 /s D = 1,3 μm 2 /s zwei verschiedene Komponenten: - freies Virus - Virus in Endosom (Stokes-Einstein: 2R 50 nm) Jedes Endosom enthielt stets nur ein AAV. 3. Single Virus Tracing 45% anomale Diffusion ( ~ Dt α ) 0,3μm 2 /s < D < 1,5μm 2 /s 0,5 < α < 0,9 Behinderung der Diffusion durch feste Bestandteile des Plasmas MSD-Plots von Partikel im Plasma: normale Diffusion, freies AAV normale Diffusion anomale Diffusion endosomal 8% gerichtete Bewegung! ( = 4Dt + (vt) 2 ) Behandlung mit Nocodazol gerichtete Bewegung verschwindet Mikrotubuli-Transport durch Ausnutzen von Motorproteinen wie Kinesin oder Dynein. Nocodazol: wird zum Depolymerisieren von Mikrotubuli verwendet. 1,8μm/s < v < 3,7μm/s

29 Im Zellkern: 57% normale Diffusion 0,4μm 2 /s < D < 1,3μm 2 /s = 0,85μm 2 /s 17% anomale Diffusion 0,25μm 2 /s < D < 0,9μm 2 /s 0,6 < α < 0,9 3. Single Virus Tracing 26% gerichtete Bewegung! Einige Virusmoleküle bewegen sich nacheinander auf dem selben Pfad. Alle Pfade waren regional gleich orientiert. 0,2μm/s < v < 2,8μm/s Behandlung mit Nocodazol gerichtete Bewegung im Zellkern verschwindet Aktiver Transport in der Kernregion, obwohl dort bisher keine Mikrotubuli und Motorproteine nachgewiesen werden konnten!

30 Unterschiedliche Bewegungsarten und -Phasen: I.) Beschleunigung in Richtung Zellwand (1), mehrere aufeinanderfolgende Virus- Membran-Kontakte (2) und schnelle Endozytose (3) II.) freie und anomale Diffusion des Endosoms mit dem Virus im Plasma und im Kern (3, 4) III.) gerichtete Bewegung durch Ausnutzung von Motorproteinen im Plasma und in Röhrchenstrukturen des Kerns (4) 15 Minuten nach jeder Behandlung waren 50% der Zellen von mindestens einem Virusmolekül befallen! Die wichtigsten Ergebnisse des Single Virus Tracing: 3. Single Virus Tracing

31 Quellen: [1] Bacia et al. (2002): Probing the Endocytic Pathway in Live Cells Using Dual-Color Fluorescence Cross-Corelation Analysis. Biophysical Journal 83(2) [2] Ueda et al. (2001): Single-Molecule Analysis of Chemotactic Signaling in Dictyostelium Cells. Science Vol [3] Bräuchle et al. (2001): Real-Time Single-Molecule Imaging of the Infection Pathway of an Adeno-Associated Virus. Science Vol

32 Bildmaterial:


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