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Barbara Steiner BOKU-University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Department IFA-Tulln, Institute for Biotechnology in Plant Production,

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Präsentation zum Thema: "Barbara Steiner BOKU-University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Department IFA-Tulln, Institute for Biotechnology in Plant Production,"—  Präsentation transkript:

1 Barbara Steiner BOKU-University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Department IFA-Tulln, Institute for Biotechnology in Plant Production, Konrad Lorenz Str. 20, A Tulln, Austria University of Natural Resources and Applied Life Sciences, Vienna Department IFA - Tulln Zuchtmethodik und quantitative Genetik in der Pflanzenzüchtung - Übungen Folien Link aus : Übung: Auswertung und Erfassung von Mikrosatelliten- und AFLP-Gelen, Überprüfung der Aufspaltung, Prüfung auf Kopplung mit Chi2 – Test, Berechnung der Rekombinationsrate 1

2 SSR: GWM 720 Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B SSR: GWM 1121 Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B

3 AFLP Selektive Primer: Mse GC Sse AC

4 AFLP Mse GC Sse AC Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B

5 AFLP Mse GC Sse AC Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B aflp1 aflp2 aflp3

6 Mikrosatelliten oder: SSR Simple Sequence Repeat, STR Short Tandem Repeat, STMS Sequence-Tagged Microsatellite site, SSLP Simple Sequence Length Polymorphismus Variable Wiederholung von einfachen Sequenzen (2-5 Nukleotide, Minisatelliten 10-15). Flankierende Regionen sind innerhalb einer Art konserviert. Polymorphismen durch unterschiedliche Anzahl der repeats – INDEL Polymorphismen; Mikrosatellitenmotive sind gleichmäßig über das Genom verteilt und kommen auch in Genen vor – EST-abgeleitete SSRs; ABA/B A GAGAGAGAGAGAGAGAGA B GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA Die bekannteste Anwendung von Mini- und Mikrosatelliten ist das DNA-Fingerprinting (Jeffreys et al. 1985).

7 7 Detektion von Mikrosatelliten Polymorphismen beruhen auf INDELs, Detektion = Fragmentgrößenbestimmung Gel-basierende Systeme Agarose Gele Hochauflösende Agarosegele Native Acrylamidgele Sequenziergele (denaturierende Acrylamidgel) Agarosegel (2.5%) Acrylamidgel (6%) SSR Marker Tom316 auf 10 Tomatenlinien. Acrylamidegel hat bessere Auflösung! Pavan et al. (2008): Euphytica 162: 91-98, Sequenziergel: denaturierendes Polyacrylamid, 6%ig (LI- COR®), sehr gute Auflösung bis 2 bp Unterschied

8 Bsp: Kapillare Elektrophorese von SSR Marker Fragmentlänge von 185 bis 201 bp Detektion mittels Fluoreszenz Größenbestimmung relativ zu Standard Semi-automatische Analyse möglich Source: Kapillare Elektrophorese Kapillare Sequenzierer Chip Elektrophorese Detektion von Mikrosatelliten

9 Vor- und Nachteile von Mikrosatelliten + sehr gut reproduzierbar, wenig DNA nötig + ko-dominant + Locus spezifisch und viele SSR Marker sind genetisch kartiert + einfache Handhabung und sehr gut automatisierbar + hohe Zahl an Allelen in einem Mikrosatellitenlocus + direkt verwendbar in der marker-gestützten Selektion - Entwicklungskosten aufgrund des Sequenzierungsbedarfs - nicht für alle landwirtschaftlichen Nutzpflanzen entwickelt Anwendung Wichtiger Markertyp für die praktische Pflanzenzüchtung: Marker-gestützten Selektion, Sortenidentifizierung, genetische Diversitätsstudien, „Ankermarker“ zum Erstellen von genetischen Karten, kartieren von wichtigen Merkmalen;

10 10 AFLP-Marker Amplified Fragment Length Polymorphism Die AFLP®-Technik (Keygene 1993 Zabeau & Vos) ist eine beliebte Technik für DNA- fingerprinting. Kombination aus Restriktionsverdau mit einem/zwei Enzymen und 2-Schritt-PCR- Amplifikation Polymorphismen durch Mutation in der Restriktionsschnittstelle und INDELs. Owner: Vos et al. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Res. 11: 4407–4414.

11 selective nukleotides AFLP-flow-chart

12 12 Beispiel für ein AFLP-Gel Verdau mit den Enzymen Sse8387I und MseI Selektive primer Kombination MseAA/SseTT BC1F5 lines von Triticum durum x Triticum dicoccum Cy5 markierte Fragmente, visualisiert auf einem Fluoreszenzscanner (Typhoon TRIO)

13 13 AFLP-Elektropherogramm Parent 1 Parent 2 * * Ausschnitt mit 25 Gelspuren und 14 Polymorphismen, AFLP sind überwiegend (ca. 90% der AFLP) dominante Marker auswertbar: Bande vorhanden oder Bande fehlend * * * ca. 10% der AFLP Marker sind ko-dominant auswertbar

14 14 ABAACACACAACCAAAACCACAACA ABDBDDDBDBDDBDDBDDDDDDDDD ABAAAAAAAABBAACAAAAAABAAA ABCAACAAAAAAAACAAAACAAAAA Elter 1Elter 2 ABDDDDDDBDBBBBDDBDDDDDDDD ABDDDDDDDBBDDDDDDDBDBDDBD Und so weiter…. Beispiel 2: Auswertung für dominanten AFLP-Marker Diese beiden AFLP Banden gehören wahrscheinlich zu einem ko-dominanten AFLP Marker, daher gemeinsame Auswertung mit A, B, H möglich nach unserer Erfahrung ca. 10% der AFLPs ko-dominant e Marker (Polymorphismus : INDEL zwischen Primerbindungsstellen) WS 2014/15 Zuchtmethodik und quant. Genetik - Übungen

15 15 Vor- und Nachteile von AFLP-Markern + universell einsetzbar + keine Sequenzinformationen nötig + sehr gute Reproduzierbarkeit + große Fragmentanzahl pro PCR ( Banden) daher effiziente Methode zur Polymorphismusdetektion + wenig DNA notwendig + mit wenigen Primern große Anzahl an Kombinationsmöglichkeiten - AFLPs sind meist dominante Marker und ‚anonyme‘ Marker - sehr gute DNA-Qualität ist nötig - technisch herausfordernd - AFLP-Gele sind oft schwierig auszuwerten - keine direkte Anwendung in der marker-gestützten Selektion möglich


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