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1 Master Seminar Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen Claudia Hahn 30.05.2012.

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Präsentation zum Thema: "1 Master Seminar Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen Claudia Hahn 30.05.2012."—  Präsentation transkript:

1 1 Master Seminar Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen Claudia Hahn

2 2 Inhalt Einleitung Stokes Shift Qualitative und quantitative Messung Fluoreszenzmikroskop Nachweis des Proteins NHE 7 Problem des Fluoreszenznachweises Zusammenfassung

3 3 Einleitung Fluoreszenz: Fähigkeit der Absorption von Photonen und die spätere Abgabe eines Teils der absorbierten Energie Energie von Photonen: E = hv Betrachtung des Photons als Welle: E = hc/λ  Photonen geringer Wellenlänge besitzen eine höhere Energie als langwellige Photonen

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5 5 Stokes Shift Bei der Emission der Fluoreszenz wird zusätzlich Wärme abgegeben Folge: Anregungswellenlänge ist kleiner also Energiereicher Emissionswellenlänge ist größer also Energieärmer Der Shift (Verschiebung) beträgt nm

6 6 Emissionswellenlänge so wählen, dass sie keine andere Fluoreszenz hervorruft, die die eigentliche überlagert Bei mehreren Parametern Emissions- und Anregungswellenlängen dürfen sich nicht überlagern

7 7 Qualitative und Quantitative Messung Qualitative Messung Änderung der Intensität durch Bindung des Liganden (Fluo-4) => Keine Messung der Konzentration möglich

8 8 Quantitative Messung Abhängig von Ligandenkonzentration => Änderung der Anregungs- und Emissionsspektren (Fura-2) => Konzentrationsbestimmung möglich

9 9 Fluoreszenzmikrokop

10 10 Nachweis des Proteins NHE 7 1 µL gewaschene Erythrocyten in 1 ml PBS suspendiert Primärantikörper (1 Stunde) Zugabe des Sekundärantikörpers (Rhodamin gebunden) (1 Stunde) => Fluoreszenzmikroskopie

11 11 Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

12 12 Kontrollmessung im FACS Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

13 13 Messergebnis der behandelten Zellen Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

14 14 Problem des Fluoreszenznachweises Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

15 15 Problem des Fluoreszenznachweises Bindestelle des primären Antikörpers ist am C-terminalen Ende von NHE 7  Antikörper muss durch die Membran diffundieren Der sekundäre Antikörper muss ebenfalls durch die Membran diffundieren Am sekundären Antikörper ist Rhodamin gebunden Damit die Diffusion gewährleistet werden kann muss die Membran durchlässig gemacht werden  Verwendung verschiedener Suspensionslösungen

16 16 PBS mit Triton-X Triton-X = Detergenz  Permeabilisierung der Zellmembran Zunächst Test des Verhaltens der Zellen Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

17 17 PBS mit Glycerin Suche nach Substanz, die Zellen permeabel machen aber nicht zerstören => Glycerin Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

18 18 Mikroskopie der Zellen in PBS und Glycerin Viel Hintergrundfluoreszenz Keine spezifische Fluoreszenz erkennbar Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

19 19 PBS mit DMSO Zunächst der Test ob die Zellen hämolysieren Geringfügige Formänderung, aber keine Hämolyse Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

20 20 Auch hier konnte nur Hintergrundfluoreszenz gemessen werden Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

21 21 Zusammenfassung der betrachteten Versuche Die hier vorgestellten Substanzen hatten keinen Einfluss auf die Permeabilität der beiden Antikörper  Neue Methoden zur Permeabilisierung der Membran müssen gefunden werden  Verwendung eines anderen sekundären Antikörpers (Rhodamin evtl. zu groß)  Empfindlichere Nachweise: FACS oder konfokales Mikroskop  Andere Nachweismethoden als Fluoreszenz einsetzen

22 22 Referenzen Attaphitaya S, Park K and Melvin JE. Molecular cloning and functional expression of a rat Na+/H+ exchanger (NHE5) highly expressed in brain. J Biol Chem 274: , Baird NR, Orlowski J, Szabo EZ, Zaun HC, Schultheis PJ, Menon AG and Shull GE. Molecular cloning, genomic organization, and functional expression of Na+/H+ exchanger isoform 5 (NHE5) from human brain. J Biol Chem 274: , Bookstein C, DePaoli AM, Xie Y, Niu P, Musch MW, Rao MC and Chang EB. Na+/H+ exchangers, NHE-1 and NHE-3, of rat intestine. Expression and localization. J Clin Invest 93: , Bookstein C, Musch MW, DePaoli A, Xie Y, Rabenau K, Villereal M, Rao MC and Chang EB. Characterization of the rat Na+/H+ exchanger isoform NHE4 and localization in rat hippocampus. Am J Physiol 271: C , Goyal S, Vanden Heuvel G and Aronson PS. Renal expression of novel Na+/H+ exchanger isoform NHE8. Am J Physiol 284: F467-F473, 2003.

23 23 Hoogerwerf WA, Tsao SC, Devuyst O, Levine SA, Yun CH, Yip JW, Cohen ME, Wilson PD, Lazenby AJ, Tse CM and Donowitz M. NHE2 and NHE3 are human and rabbit intestinal brush-border proteins. Am J Physiol 270: G29-41, Kapus A, Grinstein S, Wasan S, Kandasamy R and Orlowski J. Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchanger stably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence, osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269: , Lang J, Untersuchungen zur Existenz von NHE-Isoformen in Plasmamembranen humaner Erythrozyten 2012 Numata M and Orlowski J. Molecular cloning and characterization of a novel Na+,K+/H+ exchanger localized to the trans-Golgi network. J Biol Chem 276: , Numata M, Petrecca K, Lake N and Orlowski J. Identification of a mitochondrial Na+/H+ exchanger. J Biol Chem 273: , Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu AA, Wu MS, Exner M, Isenring P, Igarashi P and Aronson PS. Immunochemical characterization of Na+/H+ exchanger isoform NHE4. Am J Physiol 275: F510-F517, Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

24 24 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit


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