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Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI) Zielzellen in Kulturschale.

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Präsentation zum Thema: "Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI) Zielzellen in Kulturschale."—  Präsentation transkript:

1 Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI) Zielzellen in Kulturschale Selektion und Isolation der erfolgreich transfizierten Zellen GI Zellen bilden gewünschtes Protein (z.B. ein Transporterprotein)

2 Stabil transfizierte Zellen in-vitro Testung der Efflux-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen Zugabe von Substrat Nicht transfizierte Kontrollzellen transfizierte Zellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist, Kontrollzellen nicht oder deutlich weniger, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird Abwaschen des nicht aufgenommenen Substrates Lyse der Zellen Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen.

3 in-vitro Testung der Transporterinhibition von endogen exprimierenden oder stabil transfizierten Zellen Inhibitor zu den den zu untersuchenden Transporter exprimierenden Zellen geben, Kontrollzellen ohne Inhibitor Kontrollzellen Inhibitor lagert sich an Transporter an Abwaschen des überschüssigen Inhibitors Zugabe von Substrat Kontrollzellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist. Die inhibierten Zellen nehmen weniger oder kein Substrat auf, da der Transporter blockiert ist Abwaschen des überschüssigen Substrates Lyse der Zellen Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen inhibierten Zellen und Kontrollzellen.

4 in-vitro Testung der Influx-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen Zellen lysieren Stabil transfizierte ZellenNicht transfizierte Kontrollzellen Membranen isolieren ggfs. apikale und balolaterale Membranen trennen Membranen bilden inside-out-Vesikel, d.h. die inneren Membranbestandteile liegen außen und umgekehrt Zugabe von Substrat Substrat gelangt über Influx-Transporter in das Innere der Vesikel über Membranen der transfizierte Zellen, wenn Substrat transporterspezifisch ist, die Vesikel der Membranen der Kontrollzellen nehmen kein Substrat oder nur wenig auf, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird Abwaschendes nicht aufgenommenen Substrates Homogenisieren der Vesikel Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen.


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