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Klinische Mikrobiologie AKH Wien > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter.

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Präsentation zum Thema: "Klinische Mikrobiologie AKH Wien > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter."—  Präsentation transkript:

1 Klinische Mikrobiologie AKH Wien > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter

2 Kennen Sie dieses Szenario? Fiebernder, vortherapierter ICU-Patient Infektion? Sepsis = SIRS durch Infektion Wenn ja, welche? Gefragt wäre rasch ein relevanter Befund Erreger, Empfindlichkeitsprofil

3 Warum ist Sepsis- diagnostik wichtig? Haupttodesursache auf nichtkardiologischen ICU Direkte Behandlungskosten in D: 1,1 bis 2,45 Milliarden Euro/Jahr Therapie oft empirisch 11% - 46% ICU Patienten initial falsch therapiert 1, 2, 3 Zeitfaktor essentiell für Outcome Letalität hoch (40%) 1 Kollef M, Chest, Garnacho-Montero J, CCM, Byl B, CID, 1999

4 Von welchen Infektionen geht eine Sepsis am häufigsten aus? Lunge 44.0% Harnwege 9.1% Bauchorgane 8.6% Wunden und Weichteile 6.6% Katheter 2.2% ZNS 0.8% Herzklappen 0.6% Andere (z.B. Sinus) 10.8% Bakterien im Blut (positive Blutkultur)17.3% (Angus DC, Crit Care Med 2001; 29: )

5 Anteil positiver Blutkulturen AKH Wien 2005 Krankenhaushygiene, AKH Wien

6 Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik Blutkultur (BK) Diagnostik - Neu PNA-FISH aus BK Light Cycler ® SeptiFAST aus EDTA-Blut rDNA-Sequenzanalyse Diagnostik - In Entwicklung Chip-Techniken

7 Alt, aber gut: die BK Blutmenge ist DER entscheidende Faktor! Bakteriämie: Erwachsene <1-10 KBE/ml Kinder 10->100 KBE/ml Gesamtvolumen: ml (Kinder 1-5 ml) Standard: 1 aer. + 1anaer. Fl. od. 2 aer. Flaschen

8 Wann BK abnehmen? Möglichst früh bei Symptomen, die auf eine Sepsis hinweisen Vor Behandlungsbeginn, ansonsten am Ende eines Antibiotika – DI 2-3 Kulturen in rascher Folge Bei negativem Ergebnis nach 24h WH! Keine Überwachungs-BK Keine follow-up BK nach Diagnosestellung

9 Diagnostischer Zeitrahmen BK Tag 1Tag 2Tag 3Tag 4Tag 5Tag 6Tag 7 Tag 28 PILZE Blutkultur Gram ID + AB Empirische AB-Therapie Anpassen – De-Eskalieren

10 Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik Blutkultur (BK) Neu PNA-FISH aus BK Light Cycler ® SeptiFAST aus EDTA-Blut rDNA-Sequenzanalyse In Entwicklung Chip-Techniken

11 PNA-FISH Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ Hybridization Fluoreszierende PNA Sonde hybridisiert mit ribosomaler RNA Blut-Kultur Identifikation in 2.5 h Für in vitro Diagnostik

12 Diagnostischer Zeitrahmen PNA-FISH vs. BK: - 1d Tag 1Tag 2Tag 3Tag 4Tag 5Tag 6Tag 7 Tag 28 -> PILZE Blutkultur Gram ID + AB Empirische AB-Therapie Anpassen – De-Eskalieren !

13 PNA-FISH: Target rRNA Hoch konserviert Kopien/Zelle (natürliche Amplifikation) rRNA Sequenzen = taxonomische Referenz

14 Schnell-ID positiver BK S. aureus PNA FISH Yeast GPCC Gram Fbg. GPCPC C. albicans PNA FISH E. faecalis PNA FISH

15 Light Cycler ® SeptiFAST aus EDTA-Blut Multiplex Real-time PCR am Light Cycler 2.0 (Roche) Diagnostics

16 The LightCycler SeptiFast Test Hypothesis: DNA in human blood? Kultur PCR human DNA freie DNA lebende Bakterien/Pilze tote Bakterien/Pilze phagozytierte Bakterien/Pilze lebende Bakterien/Pilze lebende, phagozytierte Bakterien/Pilze (?) Diagnostics

17 Single Copy Genes No enhancement Less investigated Spacer Region (ITS*) Multiple copies Well investigated Especially suited for Species testing Ribosomal Genes Multiple copies Well investigated Especially suited for Group testing * ITS = internal transcribed spacer The LightCycler SeptiFast Test Target Region – Internal Transcribed Spacer Multiple specific HybProbe probes Diagnostics

18 Das HybProbe Prinzip 2 Sonden = benachbart hybridisierendes Oligopaar Signal (FRET) nur wenn beide nebeneinander binden Sequenz-spezifische Detektion + Mutationsanalyse in der Hybprobe-Targetsequenz durch Schmelzkurvenanalyse möglich!

19 The LightCycler SeptiFast Test Negative Control / Internal Control - MagNA Lyser Instrument - Sample Preparation LightCycler Instrument Sample or Negative Control Purified NA Internal Control Lysis Extraction The LightCycler SeptiFast Kit 50 µl eluate each Gram (-)Gram (+) Fungi Diagnostics

20 The LightCycler SeptiFast Test Channel distribution Gram (+) t [°C] CoNS from SML Staphylococcus aureus S. spp from SML (670) Streptococcus pneumoniae S.pneu S.aureus S.spp S. spp. from SML (610) CoNS S.spp Internal Control Enterococcus faecium Enterococcus faecalis ICE.fum E.fis Channel 610 Channel 640 Channel 670 Channel 705 Diagnostics

21 Gram (-) Enterobacter (cloacae / aerog.) Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) Escherichia coli Serratia marcescens Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia Gram (+)Fungi Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei Aspergillus fumigatus Streptococcus spp. 2 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Each bullet point represents a specific melting point, species in brackets are not differentiated Staphylococcus aureus CoNS 1 Strep. pneumoniae SeptiFast Master List 1 Coagulase Negative Staphylococci (Species which represent the group are listed in the PI). 2 Species which represent the group Streptococcus spp. are listed in the PI. 3 Species referred as A. calcoaceticus- A.baumannii are not detected.

22 Keimspektrum AKH Wien 2005 Sepi 25% Sau 12% Staphylokokken Enterobakterien Streptokokken Enterokokken Pseudomonas Candida Andere E. coli 9% Klebsiella 5% Enterobacter 3% % Krankenhaushygiene, AKH Wien

23 Tag 1Tag 2Tag 3Tag 4Tag 5Tag 6Tag 7 Tag 28 -> PILZE Blutkultur Gram ID + AB Empirische AB- Therapie Anpassen – De-Eskalieren ! 6 h SeptiFAST

24 rDNA-Sequenzanalyse Real-time PCR + Sequenzierung

25 rDNA-Sequenzanalyse 16S rDNA für Bakterien 18S, 28S rDNA & ITS1 & 2 Region für Pilze Direkt von Patientenprobe Amplifikation mit universellen Primern Sequenzieren der Amplicons Alignment mit Datenbank

26 Real-time PCR-Amplifikation 16S rDNA Universelle Primer rDNA Operon 16S rDNA = universelles bakterielles Gen Konservierte Regionen … Primertarget Hypervariable Regionen (zB V3) … Phylogenetische Analyse Zielgene

27 Sequenzreaktion & Aufreinigung MicroSeq Komponenten dRhodamine dye Terminatoren, cycle sequencing G A C T dR110 dR6G dTAMRA dROX Überblick Sequenzreaktion

28 Editieren der Sequenz Analyse der Daten

29 Technik Anfordern: Besuchen Sie uns! klinischemikrobiologie

30 Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik Blutkultur (BK) Neu PNA-FISH aus BK SeptiFAST aus EDTA-Blut rDNA-Sequenzanalyse In Entwicklung Chip-Techniken

31 Microarrays Detektion hunderter Mikroorganismen simultan ( e Gene) Detektion wichtiger Resistenzgene Bestimmung von verschiedenen Genotypen, Mutationen Quantifikation möglich

32 Oligo-shotgun-Chip Austrian Research Center Seibersdorf genomic 16S rRNA gene- fragments Cloning of interesting genes in E.coli ( plasmids) Amplicons(oligos) of all gene fragments spotted onto chip = probes DNA* extraction from specimen (*incl. unknown bacterial DNA) -> PCR (whole bacterial DNA tagged with Cy3) Hybridization Patterns of green spots identify species + resistence present in sample

33 Diagnostischer Peptidchip Anwendung in Körperflüssigkeiten Simultane Detektion verschiedener Erreger & Resistenzen: Protein/Epitop am Chip detektiert spezifische Immunantwort

34 Peptidchip - Strategie Funded by: Co-Operate Vienna Wiener Wirtschaftförderungsfond Collection of Sera Sera from patients (with bacterial infections) Sera from healthy persons Prediction of Bacterial Antigens in silico Whole genome B cell epitopes Bacterial Epitope Identification Peptide Synthesis Peptide ELISA with Sera Validation of Antigens Peptide ELISA Peptide Chip

35 Besuchen Sie uns! klinischemikrobiologie Take home message:


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