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1 Aktuelle Aspekte der Zöliakie Herbert Wieser Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie Lichtenbergstr. 4, 85748 Garching in Zusammenarbeit mit.

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1 1 Aktuelle Aspekte der Zöliakie Herbert Wieser Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie Lichtenbergstr. 4, Garching in Zusammenarbeit mit der Europäischen Arbeitsgruppe für die Prolaminanalyse und -toxizität und den Partnern des BMBF-Leitprojekts Zöliakie

2 2 Definition Zöliakie = Einheimische Sprue = Glutensensitive Enteropathie: Lebenslange Intoleranz gegenüber Speicherproteinen (Gluten) aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer (?), die mit einer schweren Schädigung der Dünndarmschleimhaut (Zottenatrophie) einhergeht und zur Malabsorption von essentiellen Nährstoffen führt Darmzotten normalzöliakiegeschädigt

3 3 Symptome/Therapie Häufige Symptome Durchfälle Anämien Erbrechen Avitaminosen Leibblähungen Knochenschmerzen Blässe Osteoporose Gedeihstörungen Muskelschwund Wesensveränderung Gewichtsverlust Lebenslange strikte glutenfreie Diät = keine Produkte aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer außer reiner Stärke (Tägliche Aufnahme von Gluten < 20 mg) Therapie

4 4 Chronik der Zöliakie 200 a.d. Patienten mit chronischem Durchfall = koiliakos 1888 Beschreibung der Zöliakie, Behandlung durch Diät Toxische Wirkung von Gluten glutenfreie Diät / / Peptisch-tryptisches Glutenhydrolysat = toxisch Zöliakie und Einheimische Sprue = identische Krankheit Diagnose durch Dünndarmbiopsie Toxizitätsprüfung von Proteinen (in-vivo, in-vitro) Strukturaufklärung toxischer Peptide Gewebetransglutaminase = Autoantigen

5 5 Diagnose Empfehlungen der ESPGAN 1970 Symptome 1. Biopsie Atrophie glutenfreie Kost keine Beschwerden glutenhaltige Kost 3. Biopsie Atrophie Diagnose Zöliakie 1990 Symptome 1. Biopsie Atrophie glutenfreie Kost Diagnose Zöliakie IgA anti-Gliadin + IgA anti-TG + 2. Biopsie Regeneration

6 6 Aktuelle Aspekte Häufigkeit Antigen Gluten Autoantigen Transglutaminase Mechanismus Analytik Toxische Strukturen

7 7 Häufigkeit 1 : 200 Eisberg-Modell nach Logan (1991) Familien = 1 : 10, weiblich: männlich = 2:1 Genetische Disposition (HLA-DQ2) = 1 : 5 1)Diagnostizierte Zöliakie 2)Nicht-diagnostizierte Zöliakie (flache Mukosa) 3)Latente Zöliakie (normale Mukosa, erhöhte Ig-Werte)

8 8 Klassifizierung der Getreidemehlproteine Weizenprolamine = GLIADINE Weizengluteline = GLUTENINE Gliadine + Glutenine = GLUTEN (Kleber) StoffwechselproteineSpeicherproteine wasserlöslichsalzlöslichalkohollöslichunlöslich ALBUMINEGLOBULINEPROLAMINEGLUTELINE

9 9 Aminosäurezusammensetzung der Prolamine mol-% (Ausschnitt) (Wieser et al., 1980)

10 10 Homologe Gruppen der Speicherproteine GruppeM r x10 -3 WeizenRoggenGerste HMW67-88HMW-Glutenine (G)HMW-Secaline (G)D-Hordeine (G) MMW Gliadine (P) -Secaline (P) C-Hordeine (P) LMW28-39 (70) -Gliadine (P) -Gliadine (P) LMW-Glutenine (G) - -40k-Secaline (P) -75k-Secaline (G) - -Hordeine (P) B-Hordeine (G) HMW = hochmolekular(P) = Prolamine MMW = mittelmolekular(G) = Gluteline LMW = niedermolekular

11 11 2-Dimensionales Modell eines -Gliadins (Müller, Wieser 1997)

12 12 Toxizität der Kleberproteine -/+

13 13 Toxizität von Hafer 1995 Finnische Studie (Janutuinen et al.) 92 Zöliakiekranke, 6-12 Monate 45: ca. 50 g Hafer pro Tag 47: 0 g Hafer pro Tag Biopsie Ergebnis: nicht toxisch ! 1996 Irische Studie I (Srinivasan et al.) 10 Zöliakiekranke, 3 Monate 50 g Hafer (Kölln) pro Tag Biopsie, immunol. Unters. Ergebnis: nicht toxisch ! 2003 Norwegische Studie (Lundin et al.) 19 Zöliakiekranke, 3 Monate 50 g Hafer pro Tag Biopsie, immunol. Unters. Ergebnis: 1 Patient: Villusatrophie 5 Patienten: -Interferonanstieg 2003 Irische Studie II (Kilmartin et al.) 17 Zöliakiekranke Gewebekultur-Test PT-Avenin, PT-Gliadin immunol. Untersuchung Ergebnis: nicht toxisch ! Bis 1995 umstritten

14 14 Autoantigen Gewebetransglutaminase (tTG) tTG 2) R-CO-NH 2 + H 2 O R-CO-OH + NH 3 tTG 1) R-CO-NH 2 + H 2 N-tTG R-CO-NH-tTG + NH 3 LQLQPFPQPQLPYLQLQPFPQPQLPY LQLQPFPELPYLQLQPFPELPY LQLQPFPQLPYLQLQPFPQLPY H 2 N-tTG (Fleckenstein et al., 2004; Wieser et al., 2004)

15 15 Hypothesen zum Mechanismus Enzymdefekte (Peptidasemangel) Lektinartige Reaktionen Adenovirus-12-Infektion Primäre (Auto-) Immunreaktionen (Glutenpeptide/ Transglutaminase) (Schuppan, Dieterich, 1999)

16 16 Ausgangslage A.CODEX STAN : Bestimmung des N-Gehaltes (Kjeldahl) Grenzwert: 0,05 % N in der TM B.Draft Revised Standard (2000) Extraktion mit 60 %igem Ethanol ELISA Grenzwert: 20 mg Gluten/kg TM (von Natur aus glutenfrei) 200 mg Gluten/kg TM (glutenfrei gemacht) Gluten = 2 x Prolamin C.Codex Food Labelling Standard (2006 ?) Gluten = Allergen; Grenzwert 0 Prolaminstandard, Antikörper, erhitzte Lebensmittel, Hydrolysate Probleme Analytik Gluten

17 17 ELISA-Kit Gluten (Skerritt u. Hill, 1991) Kalibrierkurven für Gliadine verschiedener Weizenarten (Wieser, Seilmeier, 1999)

18 18 Herstellung eines Gliadinstandards Weizenkörner Lipide Albumine Globuline Rohgliadin Gliadin Standard vermahlen, entfetten Salzextraktion 60 % Ethanol Ultrafiltration, Lyophilisation Chemische Charakterisierung Zertifizierung (IRMM) 500 g (E. Berghofer, Wien; R. van Eckert, Graz; H. Wieser, Garching) 30 kg

19 19 Herstellung eines Antikörpers/ELISA Immunogen:Roggenprolamine (Secaline) Antikörper:monoklonal (R5) ELISA:Sandwich (R5 + R5-Meerrettichperoxidase) Spezifität:Gliadin, Secalin, Hordein (kein Avenin !) Epitop: - QQPFP - Nachweisgrenze:3,2 µg Prolamin /kg Wiederholbarkeit:7,7 % Reproduzierbarkeit:8,1 % (Valdes et al., 2003)

20 20 Analyse von erhitzten Produkten (1) Einfluss von 2-Mercaptoethanol auf die Kalibrierkurve des Gliadinstandards im R5-ELISA (Garcia et al., im Druck)

21 21 Analyse von erhitzten Produkten (2) 60 % EtOH2-ME + GUA M = Mehl = 100 % Wiederfindung von Gliadin in erhitzten Weizenteigen °C

22 22 Analyse von erhitzten Produkten (3) ProbeZusatz Gliadin a Gliadin (EtOH)Gliadin (2-ME+GUA) mg/kg % % Maisbrot b Nr. 1145,057,540144, ,521,03261, ,048,031153, ,035,533100, ,527,53476, ,012,04426, ,513,03832, ,054,539127,591 90,0<1, ,0<1,5- - a Gliadinstandard IRMM-480; Angaben entsprechen Gliadinprotein (= 86,4 % der Substanz). b Aus 10 g Mehl hergestellt und 10 min bei 240 °C verbacken. Wiederfindung von Gliadin in Maisbrot

23 23 Zusammenfassung Analytik Mit dem monoklonalen Antikörper R5 werden die Prolamine von Weizen, Roggen und Gerste mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit quantitativ erfasst. Der kombinierte Einsatz von 2-Mercaptoethanol und Guanidin erlaubt die vollständige Extraktion der Prolamine auch aus erhitzten Produkten; die Effizienz des Antikörpers wird durch das Extraktionsmittel nicht beeinträchtigt. In naher Zukunft wird ein zertifizierter Gliadinstandard zur Verfügung stehen. Das entwickelte ELISA-System wurde in einem internationalen Ringtest erfolgreich getestet und vom Codex Commitee on Methods of Analysis and Sampling (CCMAS) anerkannt. Seit kurzem sind kommerzielle Testkits erhältlich. Haferprolamine und Weizenglutenine werden nicht erfasst.

24 24 BMBF - Ideenwettbewerb BMBF - Leitprojekt Entwicklung von Weizen-, Roggen-, und Gerstenproteinen ohne Zöliakietoxizität und deren Verwendung zur Herstellung von Lebensmitteln (http://vvgvg.org)

25 25 Ziele Aufklärung toxischer Proteinstrukturen Eliminierung toxischer Strukturen durch Gentechnologie Produktion von zöliakieverträglichem, transgenem Weizen Produktion von backfähigem, transgenem Mais Produktion von zöliakieverträglichem Gluten durch transgene Hefe

26 26 Partner Wissenschaft Universität Hamburg Institut für Allgemeine Botanik und Botanischer Garten (H. Lörz, D. Becker) Technische Universität Berlin Fachbereich für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie (U. Stahl, F. Meuser) St. Thomas´ Hospital, London Rayne Institute (P.J. Ciclitira) Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie, Garching Arbeitskreis Getreideproteine (H. Wieser) Industrie Hauptsponsoren: Monsanto, Uniferm, Puratos, Bake Mark Verein zur Förderung und Verwertung von gentechnisch verbesserten Getreideprodukten

27 27 Teilprojekte Garching/London Identifizierung und Modifizierung toxischer Epitope aus Gliadinen Immunmodulation ? Toxizitätsprüfung von Gluteninen Einsatz in glutenfreien Backwaren ?

28 28 Toxizitätstests In-vivo-Test (Instillation in den Dünndarm) 500 – 1000 mg In-vitro-Test (Gewebekultur-Test) 1 mg In-vitro-Test (Stimulation der T-Lymphozyten)0,2 mg

29 29 Zöliakieaktivität synthetischer Gliadinpeptide (in vivo, Sturgess et al., 1994; in vitro, Shidrawi et al., 1995) (in vivo, Marsh et al., 1995; in vitro, Maiuri et al., 1996)

30 30 Stimulation der T-Lymphozyten durch Gliadinpeptide Zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten (in- vitro) durch Peptide aus -Gliadinen ( 57-68, 62-75) nach Desamidierung von Q65 E65 durch Transglutaminase !Kein Nachweis, dass diese Peptide in-vivo die Darmschleimhaut schädigen !Keine systematische Untersuchung, welche Aminosäuren außer E65 für die stimulierende Wirkung essentiell sind (Arentz-Hansen et al., 2000)

31 31 Methoden (1) Gliadinhydrolysat Extraktion von Gliadin aus Weizenmehl der Sorte Rektor mit 60 % (v/v) Ethanol Partialhydrolyse von Gliadin mit trägergebundenem Pepsin und Trypsin ( PT-Gliadin) Synthetische Peptide Gerät:Peptidsynthesizer (Applied Biosystems 431A) Programm:Fmoc-Chemie, Small-Scale-Synthese (1 mmol/Aminosäure) Reinigung:1) C18-Kieselgel (25-40 µm), Glassäule 3 x 30 cm, ca. 20 °C 2) C18-Kieselgel (5 µm), Stahlsäule 0,46 x 24 cm, 50 °C Reinheitsprüfung:RP-HPLC an C18-Kieselgel Identitätsprüfung:Massenspektrometrie (ESI-MS)

32 32 Methoden (2) Immunologische Untersuchungen T-Lymphozyten:Isolierung von gliadinsensitiven T-Zelllinien und -klonen von Zöliakiepatienten Stimulation:PT-Gliadin + Antigen-präsentierende Zellen (APC) Inkubation:T-Zellen + APC + Peptid (3,7 µmol/L) + 3 H-Thymidin (18-48 h, 37 °C) Messung:Radioaktivität (cpm) cpm mit Peptid Stimulationsindex = SI > 2,0 = signifikante Wirkung cpm ohne Peptid Zytokine:ELISA Toxikologische Untersuchungen Personen:4 erwachsene Zöliakiepatienten unter glutenfreier Kost Instillation:1 g PT-Gliadin, 100 bzw. 20 mg Peptid, gelöst in Wasser, 2 h Biopsie:Gewebeentnahme mit Quinton-Kapsel nach 0, 2, 4 und 6 h Messung:Enterozytenhöhe (ECH), Villushöhe (VH), Kryptentiefe (CD), Anzahl intraepithelialer Lymphozyten (IEL)

33 33 Gewebeentnahme Zellhöhe Intraepitheliale Lymphozyten Villus- höhe Krypten -tiefe (Messung an mind. 10 Villi)

34 34 Peptide Toxikologische Untersuchung G8 ( -Gliadin 56-75) C1 (ß-Casein 53-72) Immunologische Untersuchung G9 ( -Gliadin 56-75, E65) G5 ( -Gliadin 56-68, E65) G4 ( -Gliadin 62-75, E65)

35 35 Toxikologische Untersuchung (1) Enterozytenhöhe (ECH) (0 h vs. 4 h) PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8 = Gliadinpeptid C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle)

36 36 Toxikologische Untersuchung (2) Villushöhe/Kryptentiefe (VH/CD) (0 h vs. 4 h) PTG= peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8= Gliadinpeptid C1= Caseinpeptid (Negativkontrolle)

37 37 Toxikologische Untersuchung (3) Anzahl der Lymphozyten (IEL) (0 h vs. 4 h) PTG= peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8= Gliadinpeptid C1= Caseinpeptid (Negativkontrolle)

38 38 Immunologische Untersuchung (1) PeptidSIIFN G9 ( 56-75) G5 ( 56-68) G4 ( 62-75) PeptidSIIFN G9 ( 56-75) G5 ( 56-68) 537 G4 ( 62-75) 2233 PeptidSIIFN G9 ( 56-75) G5 ( 56-68) G4 ( 62-75) T-Zellklon Nr. 6 T-Zellklon Nr. 8 T-Zellklon Nr. 9 Sl = Stimulationsindex, IFN = -Interferon (pg/mL)

39 39 Immunologische Untersuchung (2) Peptide (-) SI/IFN

40 40 Immunologische Untersuchung (3) PeptideSI/IFN

41 41 Zusammenfassung Toxikologie/Immunologie Die in-vivo-Toxizitätsprüfung an vier erwachsenen Zöliakiepatienten hat gezeigt, dass das Peptid G8 ( 56-75) eine signifikante zöliakiespezifische Schädigung der Dünndarmschleimhaut hervorruft. Die immunologischen Untersuchungen haben ergeben, dass das an Position 65 desamidierte Peptid G8 (G9) eine zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten bewirkt. Für die Wirkung des Peptids sind die Positionen essentiell.

42 42 Peptidbindungsstellen

43 43 Toxizitätsprüfung der HMW-Glutenine 1Dx5 1Dy Bauplan ABC ABC Wiederkehrende Sequenzen

44 44 Preparation of Crude HMW Subunits Flour (Rektor) 50 % 2-PrOH (3x, RT) Extract Residue 50 % 2-PrOH + DTE + Tris-HCl (2x, 60 °C) Extract Residue Solubles Precipitate washing, freeze-drying HMW subunits 1Dx529.4 % 1Bx736.7 % 1By911.9 % 1Dy % acetone

45 45 RP-HPLC of Glutenin Fractions Total glutenin subunits Crude HMW subunits HMW 20 % HMW 90 %

46 46 Characterisation of Purified HMW Subunits RP-HPLC SDS-PAGE

47 47 ELISA-Result AntibodyGliadin R5 (Mendez et al., Madrid) a) Sandwich b) Competitive 0.09 % 0.16 % W6/8 (Ellis et al., London)0.18 %

48 48 Peptic Tryptic Digest of HMW Subunits Control of hydrolysis by RP-HPLC on C 18 silica gel 1.HMW subunits (400 mg) + agarose-bound pepsin (1600 U) + HCl (pH 2, 20 mL) 37 °C, 2 h – centrifugation 2.Supernatant +NaOH ( pH 7.8) + agarose-bound trypsin (10 U) 37 °C, 2 h + HCl ( pH 7.0) – centrifugation – lyophilisation of supernatant

49 49 Stimulationstest an T-Lymphozyten PatientFFIIIHMWHMWtTG ZB11,12,61,4 JB6,22,0 JD3,73,43,3 YR12,51,03,0 SB1,33,11,3 BL90,012,17,7 TS6,13,73,9 MH4,30,30,2 EL11,91,52,2 LN4,01,01,1 MT67,0Nd4,2 CM11,03,55,2 NL21,51,00,7 LB3,41,0 13/147/138/14 Angegeben ist der Stimulationsindex (SI); SI>2 = signifikante Wirkung; Nd = nicht bestimmt.

50 50 Ergebnisse ECH

51 51 Ergebnisse VH/CD

52 52 Ergebnisse IEL

53 53 Zusammenfassung HMW-Glutenine Die immunologischen und toxikologischen Untersuchungen haben ergeben, dass ein Gemisch aus den HMW- Untereinheiten Nr. 5, 7, 9 und 10 zöliakiespezifische Reaktionen hervorruft. Aus den Ergebnissen geht nicht hervor, welche der vier Untereinheiten zöliakieaktiv ist.

54 54 Ausblick Isolierung und Testung einzelner rekombinanter HMW- Untereinheiten aus transgenem Mais und transgener Hefe Mais (Uni Hamburg) Hefe (TU Berlin) 1Dy101Dx5

55 55 Danksagung Prolamin Working Group Paul J. Ciclitira, London Renate van Eckert, Graz Conleth Feighery, Dublin Enrique Mendez, Madrid BMBF-Projekt Dirk Becker, Hamburg Paul J. Ciclitira, London Erika Hinzmann, Berlin Friedrich Meuser, Berlin DFA Wolfgang Engel, Ursula Schützler, Sibylle Suckart Bundesministerium für Bildung und Forschung Verein zur Förderung und Verwertung von gentechnisch verbesserten Getreideprodukten


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