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Praktikum Molekularbiologie Klonierungsvektor DNA-Sequenzierung: Sanger DNA-Sequenzierung: next generation.

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Präsentation zum Thema: "Praktikum Molekularbiologie Klonierungsvektor DNA-Sequenzierung: Sanger DNA-Sequenzierung: next generation."—  Präsentation transkript:

1 Praktikum Molekularbiologie Klonierungsvektor DNA-Sequenzierung: Sanger DNA-Sequenzierung: next generation

2 Klonierungsvektor

3 Ligation PCR-Produkt (zukünftiges Insert) Plasmid-Vektor (pDrive, Qiagen; pBluescript, Stratagene; pGEM, Promega) Re-Ligation des Vektors Zirkuläres PCR-Produkt Vektor + Insert Ligase

4 Transformation Wachstum auf LB-AXI ? ???????? E. coli +  -- PCR-ProduktPlasmid

5 pDrive Klonierungsstelle

6 Blau/Weiß Selektion pDrive oder pBluescript lacZ‘ Ligation Klonierungsstelle Genexpression β-Galactosidaseβ -GalacXXXtosidase Aktiv: blauInaktiv: weiß β -Galacxtosidase Etwas aktiv: hellblau

7 Transformation Wachstum auf LB-AXI ?  -- blauweiß  Transformation E. coli +

8 Insert-Analyse spezifisch universell blau weiß blauweiß

9

10 DNA-Sequenzierung Sanger-Methode DNA-Polymerase Next Generation Detektion

11 PCR vs. Sequencing Reagenzien PCR DNA-Matrize dNTP (A,C,G,T) Primer forward Primer reverse PCR-Puffer Taq-Polymerase Reagenzien Sequencing DNA-Matrize dNTP (A,C,G,T) ddNTP ein Primer Sequencing-Puffer mod. Taq-Polymerase Zwei Matrizenstränge Exponentielle Zunahme Produkt mit bestimmter Größe dsDNA Ein Matrizenstrang Lineare Zunahme Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA

12 Didesoxynukleotide Aciclovir

13 PAGE: Trennung nach Größe mit hoher Auflösung! Polyacrlyamidgelelektrophorese Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA

14 DNA-Polymerase Domänen E. coli Pol I 928 As 5‘-3‘ Exonuklease 3‘-5‘ Exonuklease5‘-3‘ Polymerase

15 DNA-Polymerase Herausschneiden von ddNTPs

16 Verkürzen von Fragmenten früherer Zyklen Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA

17 DNA-Polymerase Domänen Thermo Sequenase 560 As Taq Pol 832 As dNTP Bindetasche  5‘-3‘ Exonuklease 3‘-5‘ Exonuklease5‘-3‘ Polymerase E. coli Pol I 928 As   Erleichterter Einbau ddNTPs Tabor & Richardson (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (92), F667Y

18 DNA-Polymerase Taq-DNA-Polymerase......modifiziert Ohne 3‘-5‘ Exonuklease Ohne 5‘-3‘ Exonuklease Mod. dNTP Bindetasche  Keine „Reparatur“ der ddNTP  Keine unerwünschten Fragment- längen  Verringerte ddNTP Diskriminierung

19 Detektion ist ein Problem, weil ausgehend von nur einem Primer nur lineare Amplifikation möglich!  geringe Produktmengen

20 Detektion - radioaktiv Radioaktive Markierung von dATP 33 P, 32 P 35 S

21 Detektion - Floureszenz Fluoreszenz Markierung Fam (494nm, 517nm) Hex (535nm, 553nm) Rox (587nm, 607nm)

22 Detektion – Markierung Welche Moleküle können markiert werden? ddNTPs mit vier verschiedenen Farben (Fluoreszenz) Primer am 5‘-Ende dNTPs ddNTPs

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26 pDrive Klonierungsstelle Orientierung: Spez. Primer f oder r?

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28 Jay Shendure & Hanlee Ji (2008) Next-generation DNA sequencing, Nature Biotechnology 26 (10), Next Generation Sequencing Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods, Annual Review of Genomics and Human Genetics 9:387–402

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30 Bridge PCR Denaturieren + Annealing Elongation

31 Emulsion PCR

32 454 Platform Pyrosequencing works/sequencing-chemistry.asp

33 Gharizadeh, B. et al. Typing of Human Papillomavirus by Pyrosequencing. Lab Invest 2001, 81:673–679 APS = Adenosinphosphosulfat

34 Gharizadeh, B. et al. Typing of Human Papillomavirus by Pyrosequencing. Lab Invest 2001, 81:673–679

35 Sanger cloningPolymerase ~$4000 $200, bp Assembly schwierig Hohe Fehlerrate Assembly einfach Geringe Fehlerrate Fertiges Genom als Gerüst! De Novo Sequenzierung

36 Sanger: Kettenabbruch Polymerase: modifiziert Detektion: Fluoreszenz Next Generation: Genome Take Home


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