PCR basierte-Detektionstechniken

Präsentation zum Thema: "PCR basierte-Detektionstechniken"—  Präsentation transkript:

1

2 PCR basierte-Detektionstechniken
Mi21 Martina Jahn

3 Anwendung Anwendung DNA- Abstammungsanalysen
1. Forensische Analysen DNA- Abstammungsanalysen (Vaterschaftstests, Kriminalistik) 2. Mikrobielle Gemeinschaften: Biofilme, medizinische Mikrobiologie 3. Gentechnisch hergestellte Lebensmittel Mi21 Martina Jahn

4 Anwendung minimale Mengen an DNA ausreichend zeitsparend
schneller Überblick kulturunabhängig Mi21 Martina Jahn

5 PCR- Methode (http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html)
Strangtrennung durch kurzzeitiges Erhitzen der DNA auf 95°C Hybridisierung der Primer bei spezifischer Annealingtemperatur DNA-Synthese bei 72°C durch eine hitzeresistente DNA-Polymerase Kary B. Mullis Nobelpreis 1993 Mi21 Martina Jahn 5

6 Sequenzierung von PCR-Fragmenten nach Sanger
Frederic Sanger Nobelpreis für Chemie 1980 Mi21 Martina Jahn 6

7 1. Humane Anwendungen DNA-Abstammungsanalysen Forensische Analysen
Ahnenforschung (Analyse fossiler DNA) Mi21 Martina Jahn

8 „Fingerprinting“ bei Menschen
Tandem-Repeat-Polymorphismen durch repetitive Cluster charakterisiert in nicht-kodierenden Bereichen der DNA (Introns, Pseudogene). co-dominante Vererbung Short Tandem Repeats (STR) Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Fragmentlängen-Analyse WS 10/11 Mi21 Martina Jahn 8

9 Forensic DNA-Abschnitte: Mikrosatelliten 1985-1989: meist VNTRs
46 Chromosomen (Mensch) DNA-Abschnitte: Mikrosatelliten : meist VNTRs seit 1998: STRs Genorte (Stand 2011): D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, Amelogenin, vWA, D8S1179, TPOX und FGA Wahrscheinlichkeit. 2 Individuen = gleiche Anzahl von wiederholten Repeats: 1 zu mehreren Milliarden!!! Mi21 Martina Jahn

10 DNA Abstammungsanalysen
Mikrosatelliten sind kurze Abschnitte der DNA, die in verschieden häufigen Wiederholungen vorliegen (Fragmentlängen-Analyse). Die Anzahl der Wiederholungen unterscheiden sich von Mensch zu Mensch, die Kombination des Musters dieser Wiederholungen sind einzigartig. Sie werden aber - zusammen mit dem gesamten Erbgut - von den Eltern an Ihre Kinder vererbt. Die Vererbung und die Vielfältigkeit (Polymorphie) der Mikrosatelliten machen Sie zu idealen Markern für eine genetische Abstammungsanalyse. Mi21 Martina Jahn

11 Vaterschaftstest M Kindsmutter K Kind PV Putativvater A B
Mi21 Martina Jahn

12 Eineiigige Zwillinge ?????????????? Fingerabdruck Anatomisch Genetisch
Krankheiten Mi21 Martina Jahn

13 Eineiige Zwillinge Unterscheiden sich eineiige Zwillinge?
Anatomisch? Leberflecke (u.a.), Muttermale genetisch? Nein; epigenetisch verändertes Methylierungsmuster an DNA & Histon-Acetylierungen V(D)J-Regionen der T- & B-Lymphozyten des Immunsystems (adaptive Immunsystem) Krankheiten/Allergien? Nicht zwingend Nussallergie 65% (7% bei 2-eiigen) Asthma 20% Fingerabdruck: Papillarleisten ? Nein; (umweltfaktorische Ausnahmen) WS 14/15 Mi21 Martina Jahn 13

14 2. Mikrobiologische Anwendungen
Identifizierung von Mikroorganismen in unterschiedlichen Habitaten Erregernachweis bei Infektionskrankheiten Phylogenetische Analysen Mi21 Martina Jahn

15 Phylogentische Marker
Ribosomale RNA (5S, 16S, 23S) Spezifische Gene (z.B. rpoN) Phospholipide, Fettsäuren Internal Transcribed Spacer Regions (ITS) Mi21 Martina Jahn

16 16S rRNA DNA Protein Strukturelle und katalytische Komponente der Ribosomen Hohe Kopienzahl Ca Basenpaare Ribosom Mi21 Martina Jahn

17 16S rRNA Bakterielles 70S Ribosom 23S und 5S rRNA 16S rRNA
E. Coli Thomas Steitz Nobelpreis 2009 X-stal structure ribosom Mi21 Martina Jahn

18 16S rRNA Mutationen oft letal Konstanter Selektionsdruck
Sekundärstruktur an vielen Stellen hochkonserviert Vergleich analoger variabler Bereiche Datenbanken Mi21 Martina Jahn

19 Fingerprinting „Bakteriengemeinschaften“
Mi21 Martina Jahn

20 Analytik Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)*
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)* Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)* Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)* Terminal Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (tRFLP) * = gelbasierende Auftrennung der PCR-Amplifikate Mi21 Martina Jahn

21 z. Bsp.: SSCP Unterscheidung von DNA-Molekülen derselben Länge aber unterschiedlicher Sequenz Auftrennung nach Sekundärstruktur der einzelsträngigen PCR Produkte DNA - Konformation ändert Laufverhalten Trennung in nicht-denaturierendem Polyacrylamidgel 5`- Primer trägt Phosphatrest Mi21 Martina Jahn

22 Prinzip SCCP-Gel - + Bakterium A Bakterium B A G T C
Mi21 Martina Jahn

23 Analytik SSCP Gel Densiometrische Ableitung
Mi21 Martina Jahn

24 Datenanalyse - Profilvergleich
Mi21 Martina Jahn

25 3. Gentechnisch hergestellte Lebensmittel
Mi21 Martina Jahn

26 Vorraussetzungen zur Generierung einer gentechnisch veränderten Pflanze
Kultivierung einer individuellen Pflanzenzelle (Protoplast oder Zellkultur) Regenerierung zur vollständigen Pflanzenzelle aus Protoplasten oder Zellkultur Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen genetischen Materials (DNAs) - Plasmid mit Fremdgen über/in Agrobacterium - mechanisch, durch „gene gun“ Methode Infizierte Maispflanze Mi21 Martina Jahn

27 Genetischen Materials Über Agrobacterium
Insertion neuen Genetischen Materials Über Agrobacterium Mi21 Martina Jahn

28 Gene Gun Alternative Methode der Gen Insertion – “Gene Gun”
Mi21 Martina Jahn

29 Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen
Kultivierung einer individuellen Pflanzenzelle (Protoplast oder Zellkultur) Regenerierung zur vollständigen Pflanzenzelle aus Protoplasten oder Zellkultur Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen genetischen Materials (DNAs) - Plasmid mit Fremdgen über/in Agrobacterium - mechanisch, durch „gene gun“ Methode Screen nach transformierten Pflanzen– Antibiotika Resistenz: Problem: Wie kann man von 1 bis 1000 Pflanzen die gentechnisch veränderte erkennen? Lösung: man koppelt die Antibiotika –Resistenz mit dem Gen, welches genetisch entfernt wird Mi21 Martina Jahn

30 Gentechnisch veränderter Mais
Bt – Bacillus thuringiensis – ubiquitär vorkommendes Bakterium Produziert Proteine (“crystal proteins”, Cry [>60]) welche selektiv bestimmte Gruppen von Insekten tötet Magen toxins, müssen von Insekten gefressen werden um tödlich zu wirken Proteine binden an Darmrezeptoren  Insekt stoppt Nahrungsaufnahme/verhungert seit 30 Jahren werden Bt Toxine als Pestizide in Mio to/Jahr auf Feldern versprüht Mi21 Martina Jahn

31 „Corn Borer Impact“ U.S. + Canada: > $1 Mrd per annum, Schaden und Kontrollkosten D > Euro Maiszünsler (Ostrinia nubilalis), westliche Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera) Mi21 Martina Jahn

32 Gefahren durch Genmais?
Potentielles Risiko für Menschen auf allergische Reaktionen? - Toxizität der Cry Proteine für Menschen ≤ Null - Cry1 – wird über Magensäure unschädlich für Menschen degradiert - Cry9 – moment. im Tier (Maus) Modell untersucht (bisher keine Tox.) Tötlich für andere Insektenarten? (select. für Lepidopterane): - Monarch Schmetterlinslarve ja: Bt Toxin, aber Schmetterling geht nicht auf Maispflanze Mi21 Martina Jahn

33 Transgener Reis Anbau + H2O Ist – H2O Gewünscht – H2O
Raipur Indien 2005 Mi21 Martina Jahn

34 Transgener Golden Reis
Gentechnisch verändert: Enthält ß Carotin, welches sich in Vitamin A umwandelt Mi21 Martina Jahn

35 Gentomate „ Anti-Matschtomate“
1994 Flavr Savr Tomate: entwickelt in USA; von Monsanto auf dem Markt 1997 mangels Nachfrage eingestellt 2010: indische Forscher: Tomaten haltbarer durch α-Mannosidase und ß-D-N-Acethylhexosaminidase die das Weichwerden Der Tomaten inhibieren (für zusätzliche 30 Tage) Mi21 Martina Jahn

36 Transgene Baumwolle Ein oder mehrere Gene des Bodenbakteriums B. thuringiensis werden in die chromosomale DNA der Baumwollpflanze integriert → produzieren Toxine gegen Schädlinge (Käfer, Schmetterlinge, Zweiflügler, Baumwolleule Transgene Baumwolle wurde 2009 in 12 Ländern angebaut: Argentinien (95%), Australien (95%), Brasilien (18%), Burkina Faso (29%), China (60%), Indien (89%), Kolumbien (31%, 2007), Mexiko (56,5%), Südafrika (98%), USA (88%), Indonesien, und Costa Rica. Baumwollkapselbohrer Mi21 Martina Jahn

37 Warum die öffentliche Angst über Biotech Lebensmittel?
Unwissenheit über die Technologie Fehlen verlässlicher Informationen Unwissenheit über genetisch eingebaute „Safeguards“ Negative Medienpräsens und –meinung Opposition durch Aktivistengruppen Misstrauen der Industrie Mi21 Martina Jahn

38 Mi21 Martina Jahn