Doping im Sport Wilhelm Schänzer Institut für Biochemie Zentrum für Präventive Dopingforschung Deutsche Sporthochschule Köln Köln 23. September 2009.

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1 Doping im Sport Wilhelm Schänzer Institut für Biochemie Zentrum für Präventive Dopingforschung Deutsche Sporthochschule Köln Köln 23. September 2009

2 Dopingnachweis Könnten Dopingsubstanzen zum besseren Nachweis markiert werden? Welche Eigenschaften müsste der Marker besitzen ? Keine Beeinflussung der pharmakologischen Eigenschaften Gute analytische Nachweisbarkeit Lange Verweildauer im Organismus >> lange Nachweisbarkeit Vorkommen nur in Dopingsubstanzen Problem Pharmafirmen müssten das jeweilige Zulassungsverfahren sowie alle präklinischen und klinischen Studien neu vornehmen Illegal hergestellte Dopingmittel werden nicht erfasst

3 Dopingkontrolle und Analytik
„Leider ist die Dopingkontrolle viel komplizierter“ Urin Isolierung GC/MS-Analyse GC / MS-Gerät Labor Analyse Versiegelte Urinprobe Positiver Dopingbefund

4 Dopingdefinition Zuständigkeit für den weltweiten Anti-Doping-Kampf
bis IOC Internationales Olympisches Komitee ab WADA Welt Anti-Doping Agentur Artikel 1 Definition von Doping Doping ist definiert als ein Verstoß gegen die Anti-Doping-Regeln wie sie in Artikel 2.1 bis 2.8 ausgewiesen sind. Artikel 2 Verstöße gegen die Anti-Doping-Regeln 2.1 Die Anwesenheit einer verbotenen Substanz, deren Metaboliten oder eines Markers in einer dem Athleten entnommenen Probe 2.2 Die Anwendung bzw. der Versuch der Anwendung einer verbotenen Substanz oder einer verbotenen Methode

5 Dopingdefinition 2.3 Verweigerung der Abgabe einer Probe nach Aufforderung zur Dopingkontrolle 2.4 Abwesenheit bei Kontrollen außerhalb des Wettkampfes einschließlich Verstöße gegen der Aufenthaltsmeldepflicht 2.5 Betrug oder der Versuch eines Betruges bei der Dopingkontrolle 2.6 Besitz von verbotenen Substanzen oder verbotenen Methoden 2.7 Weitergabe jeglicher verbotenen Substanz oder verbotenen Methode 2.8 Anstiftung, Mitbeteiligung, Unterstützung oder Ermutigung zur Anwendung oder zum Versuch einer Anwendung einer verbotenen Substanz oder verbotenen Methode

6 Dopingliste des IOC 1972 Verbotene Substanzen und Methoden während des Wettkampfes Diuretika u.a. maskierende Substanzen Stimulanzien Narkotika Verbotene Substanzen in bestimmten Sportarten Alkohol, (Tranquilizer)

7 Dopingliste der WADA 2008 Verbotene Substanzen und Methoden während des Wettkampfes S1 Anabole Wirkstoffe Anabol androgene Steroide Andere anabole Wirkstoffe S2 Peptidhormone S3 ß2-Agonisten S4 Hormonantagonisten und Modulatoren S5 Diuretika u.a. maskierende Substanzen S6 Stimulanzien S7 Narkotika S8 Cannabinoide S9 Glucocorticosteroide M1 Verbesserung des Sauerstofftransports Blutdoping künstliche Sauerstoffträger M2 Manipulationen M3 Gendoping Verbotene Substanzen in bestimmten Sportarten Alkohol, Beta-Blocker

8 Dopingliste der WADA 2008 Verbotene Substanzen und Methoden außerhalb des Wettkampfes S1 Anabole Wirkstoffe Anabol androgene Steroide Andere anabole Wirkstoffe S2 Peptidhormone S3 ß2-Agonisten S4 Hormonantagonisten und Modulatoren S5 Diuretika u.a. maskierende Substanzen S6 Stimulanzien S7 Narkotika S8 Cannabinoide S9 Glucocorticosteroide M1 Verbesserung des Sauerstofftransports Blutdoping künstliche Sauerstoffträger M2 Manipulationen M3 Gendoping

9 Laboratories for doping control analyses ACCREDITED
BY THE WORLD ANTI-DOPING AGENCY Stockholm Oslo Helsinki Warsaw Ghent Moscow Cologne London Kreischa Paris Prague Montreal Seibersdorf Lausanne Barcelona Rome Bukarest Beijing Salt Lake City Lisbon Madrid Ankara Seoul Athens Tokyo Los Angeles Tunis Delhi Havana Bangkok Penang Bogota Rio de Janeiro Bloemfontein Sydney 35 Laboratories, September 2009

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12 Doping bei den Olympischen Spielen 1972 in München
2079 Dopingkontrollen positive Dopingbefunde Substanz Gruppe Sportart Land Amphetamin S6 Gewichtheben Österrreich Ephedrin Baketball Puerto Rico Schwimmen USA Japan Nikethamid Radfahren Niederlande Spanien Phenmetrazin Judo Mongolei Weitere 14 Fälle im Modernen Fünfkampf, die nicht sanktioniert wurden.

13 Doping bei den Olympischen Spielen 2008 in Peking
ca Dopingkontrollen positive Dopingbefunde Substanz Gruppe Sportart Land Methyltestosteron S1 Leichtathletik Ukraine Methyltrienolon Griechenland Nandrolon Gewichtheben Testosteron Weißrussland Clenbuterol Kajak Polen EPO S2 Radfahren Spanien CERA (5 Fälle) Rad, Leichtathletik, Gewichtheben Furosemid S5 Turnen Vietnam Propranolol P2 Schießen Nordkorea Weitere 5 Fälle wurden im Pferdesport mit der Substanz Capsaicin (4) und Felbinac (1) bestimmt. Für diese Kontrollen ist der Internationale Pferdesportverband (FEI) zuständig.

14 Doping bei den Olympischen Spielen 2008 in Peking
ca. 30 positive Dopingbefunde im Vorfeld der Olympischen Spiele (Athleten, die möglicherweise in Peking gestartet wären) Substanz Gruppe Sportart Land Methyltrienolon (11) S1 Gewichtheben Griechenland Methyltrienolon (2) Leichtathletik Methyltrienolon (1) Schwimmen Metandienon (11) Bulgarien EPO (2) S2 Leichtathletik Gehen (2) Russland Manipulation (7) M2 Leichtathletik Diskuswurf (1) Hammerwurf (1) 800m (2) 1500m (3)

15 Usain Bolt Michael Phelps Lance Armstrong

16 Nachanalysen der Tour de France 1998 und 1999
- Forschungsprojekt im Jahr 2004 - Französische Kontrolllabor - Urintest für EPO erst ab 2001 in der Anwendung - Langzeitgelagerte Proben der Tour de France aus den Jahren 1998 und 1999 - Nachanalyse mit dem Urintest für EPO Ergebnisse Jahr Probenanzahl EPO positiv 1998 70 40 1999 80 12

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18 Dopingkontrolle und -analytik
Athlet wird kontrolliert Urinprobe Dopingverstoß Disqualifikation 2 Jahre Sperre Amphetamin („Wettkampfdoping“) Analytischer Nachweis A-Probe : B-Probe C H 2 3 N

19 Dopingkontrolle und -analytik
Athlet wird kontrolliert Urinprobe Dopingverstoß Disqualifikation 2 Jahre Sperre Testosteron Analytischer Nachweis A-Probe : B-Probe Differenzierung zwischen körpereigener Produktion und exogener Zufuhr (Doping)

20 Dopingkontrolle Athlet wird direkt nach Positive Urinprobe
Einnahme von Amphetamin Tage vor dem Wettkampf Einnahme von Nahrungs- Ergänzungsmitteln ? Manipulation durch Konkurrenten ? Einnahme von Amphetamin vor dem Wettkampf Athlet wird direkt nach dem Wettkampf kontrolliert Positive Urinprobe

21 Dopingkontrolle Athlet wird direkt nach Wettkampfkontrolle
dem Wettkampf kontrolliert Wettkampfkontrolle Verweigerung der Kontrolle Manipulation der Urinprobe Urinaustausch Zusatz von Chemikalien Verdünnung der Urinprobe Maskierungsmittel etc. Negative Urinprobe

22 Dopingkontrolle Athlet wird außerhalb des Trainingskontrolle
Wettkampfes kontrolliert Trainingskontrolle zusätzliche Problembereiche Erreichbarkeit Inland Ausland Internationale Harmonisierung Zeitpunkt der Kontrolle Verweigerung der Kontrolle Manipulation der Urinprobe Urinaustausch Zusatz von Chemikalien Verdünnung der Urinprobe Maskierungsmittel etc. Negative Urinprobe

23 Koksnase Stimulanzien Cocain Amphetamin Ephedrin

24 Dopingliste der WADA Verbotene Substanzen und Methoden S6 Stimulanzien
Adrafinil, Adrenalin, Amfepramon, Amiphenazol, Amphetamin, Amphetaminil, Benzphetamin, Bromantan, Carphedon, Cathin**, Clobenzorex, Cocain, Cropropamid, Crotetamid, Cyclazodon, Dimethylamphetamin, Ephedrin***, Etamivan, Etilamphetamin, Etilefrin, Famprofazon, Fenbutrazat, Fencamfamin, Fencamin, Fenetyllin, Fenfluramin, Fenproporex, Furfenorex, Heptaminol, Isomethepten, Levmethamfetamin, Meclofenoxat, Mefenorex, Mephentermin, Mesocarb, Methamphetamin (D-), Methylendioxyamphetamin, Methylendioxymethamphetamin, p-Methylamphetamin, Methylephedrine***, Methylphenidat, Modafinil, Nikethamid, Norfenefrin, Norfenfluramin, Octopamin, Ortetamin, Oxilofrin, Parahydroxy-Amphetamin, Pemolin, Pentetrazol, Phendimetrazin, Phenmetrazin, Phenpromethamin, Phentermin, Prolintan, Propylhexedrin, Selegilin, Sibutramin, Strychnin und andere Substanzen mit ähnlicher chemischer Struktur oder ähnlicher biologischer Wirkung ** Cathin ist verboten, wenn die Urinkonzentration > 5 µg / ml Urin ist *** Ephedrin und Methylephedrin sind verboten, wenn die Urinkonzentration > 10 µg / ml Urin ist

25 Dopingliste der WADA Wirkungen der Catecholamine
aus Lüllmann, Mohr, Ziegler: Taschenatlas der Pharmakologie, Thieme-Verlag, Suttgart-New York 1994

26 Positive Befunde mit Stimulanzien 2003-2005
Substanzen Anzahl Amphetamin 349 Mephentermin 4 Ephedrin 295 Fenethyllin 3 Cocaine 208 Methylephedrin MDMA 37 Clobenzorex 2 Methylphenidat 33 Fenfluramine Phentermin 32 MDEA Heptaminol 29 Metamphetamin 28 Phendimetrazin Cathin 25 Strychnin Nikethamid 21 Bromantan 1 Etilefrin 11 Cropropamid MDA Crothetamid Modafinil 10 Dimethamphetamin Pemolin Doxylamin Amfepramon 7 Fenproporex Benzylpiperazin Mesocarb Carphedon 8 Parahydroxyamphetamin Fenetyllin 6 Pholedrin Norfenfluramin Propylhexedrin Etamivan Positive Befunde mit Stimulanzien Dopingbefunde weltweiter Kontrollen Stimulantien ( ) (Statistik der WADA akkreditierten Laboratorien) ca Dopingkontrollproben (nur Wettkampfproben) mit ca (0.29%) positiven Befunden (A-Proben)

27 S1 Anabole Wirkstoffe Zur Verbesserung des Muskelaufbaus in der “Trainingsphase“ Anabolika Training

28 Dopingliste der WADA A. Exogene AAS: B. Endogene AAS:
Verbotene Substanzen und Methoden S1 Anabole Wirkstoffe 1. Anabol Androgene Steroide (AAS) A. Exogene AAS: bolasterone; boldenone; boldione; calusterone; clostebol; danazol; dehydrochloromethyl-testosterone; delta1-androstene-3,17-dione; delta1-androstenediol; delta1-dihydro-testosterone; desoxymethyltestosterone; drostanolone; ethylestrenol; fluoxymesterone; formebolone; furazabol; gestrinone; 4-hydroxytestosterone; 4-hydroxy-19-nortestosterone; mestanolone; mesterolone; metenolone; methandienone; methandriol; methyldienolone; methyl-1-testosterone; methylnortestosterone; methyltrienolone; methyltestosterone; mibolerone; nandrolone; 19- norandrostenediol; 19-norandrostenedione; norbolethone; norclostebol; norethandrolone; oxabolone; oxandrolone; oxymesterone; oxymetholone; quinbolone; stanozolol; stenbolone; tetrahydrogestrinone; trenbolone and other substances with a similar chemical structure or similar biological effect(s). B. Endogene AAS: androstenediol (androst-5-ene-3β,17β-diol); androstenedione (androst-4- ene-3,17-dione); dehydroepiandrosterone (DHEA); dihydrotestosterone; testosterone.

29 Testosteron (Steroidhormon)
männliches Sexualhormon androgene und anabole Wirkung - androgene Wirkung Förderung von Wachstum und Differenzierung der männlichen Fortpflanzungsorgane, Ausbildung sekundärer Geschlechtsmerkmale wie Bartwuchs und Vergrößerung des Kehlkopfes. - anabole Wirkung vor allem in der Pubertät - Ausbildung des typisch männlichen Muskel- und Skelettwachstums

30 Anabolika: Anabol Androgene Steroide (AAS)

31 Am meisten missbrauchte Anabolika

32 Tetrahydrogetrinon (THG)
Doping mit Designer-Steroiden The Balco story 2003, California Tetrahydrogetrinon (THG)

33 Doping mit Anabolika Methyltrienolon O H CH O
Bei einer Trainingskontrolle In April 2008 werden von 11 griechischen Gewichthebern 9 mit Methyltrienolon überführt O H CH 3 O

34 C H O Testosteron Testosteron - Nachweis 1 9 2 8 2
Chemische Grundstruktur C H O 1 9 2 8 2 körpereigene Synthese

35 C H O Testosteron Testosteron - Nachweis 1 9 2 8 2
Chemische Grundstruktur C H O 1 9 2 8 2 Testosteron für die Medizin

36 IOC-Regel: Testosteron Verbot
Konzentration cT / cEpi = ca. 1 Testosteron Epitestosteron

37 IOC-Regel: Testosteron Verbot
Konzentration cT / cEpi > 4 positiv ? Testosteron Epitestosteron

38 Individuelle Schwankungen des T/E-Quotienten

39 Nachweis von Testosteron
Postiver Befund aufgrund individueller Referenzwerte

40 Endogenes Testosteron Testosteron für die Medizin
Testosteron – Nachweis Isotopenbestimmung Testosteron Chemische Grundstruktur C H O 1 9 2 8 2 Endogenes Testosteron Testosteron für die Medizin 13 12 13 12 C / C C / C 0.011 0.011 22.0 promill 28.0 promill

41 Positive Befunde mit Anabolika 2003-2005
Positive Dopingbefunde weltweiter Kontrollen Anabol Androgene Steroide (AAS) ( ) (Statistik der WADA akkreditierten Laboratorien) Substanzen Anzahl Testosteron** 900 Oxymetholon 11 Nandrolon 893 1-Testosteron Stanozolol 618 1-Androstendiol 8 Methandienon 178 Trenbolon 7 Boldenon 63 Danazol 4 Metenolon 61 Dehydrochlormethyl- testosteron Methyltestosteron 51 Mestanolon Mesterolon 45 Etiocholanolone Prasteron (DHEA) 27 Fluoxymesteron 3 Androsteron 22 Methandriol Clostebol* 15 Boldion 1 Oxandrolon 14 Norethandrolon Tetrahydrogestrinon Oxymesteron Drostanolon 12 Dihydrotestosteron Androstendion 5ß-Androstandiol ca Dopingkontrollproben mit ca (0.41%) positiven Befunden (A-Proben) ** Daten von Testosteron konnten nur geschätzt werden

42 Dopingliste und Analytik - aktuelle Problembereiche
Verbotene Substanzen und Methoden S1 Anabole Wirkstoffe Anabol androgene Steroide (AAS) exogene und endogene AAS (z.B.Testosteron) Andere anabole Wirkstoffe S2 Peptidhormone (z.B. HGH, EPO, Insulin) S3 ß2-Agonisten S4 Hormonantagonisten und Modulatoren S5 Diuretika u.a. maskierende Substanzen S6 Stimulanzien S7 Narkotika S8 Cannabinoide S9 Glucocorticosteroide M1 Verbesserung des Sauerstofftransports Blutdoping (z.B. Eigenblutdoping) künstliche Sauerstoffträger M2 Manipulationen M3 Gendoping Verbotene Substanzen in bestimmten Sportarten Alkohol, Beta-Blocker

43 Dopingliste der WADA Verbotene Substanzen und Methoden
S2. HORMONE und verwandte Substanzen Die folgenden Substanzen und ihre Releasingfaktoren sind verboten: Erythropoietin (EPO) Wachstumshormon (hGH), Insulin-like Growth Factor (z.B. IGF-1), Mechano Growth Factors (MGFs) Gonadotrophine (z.B. LH, hCG), nur bei Männern verboten; Insulin* Corticotropine und andere Substanzen mit ähnlicher chemischer Struktur oder ähnlicher biologischer Wirkung(en) * An Diabetes erkrankte Sportler müssen eine Therapeutische Ausnahmeregelung (TUE) beantragen

44 Wirkung von EPO (Erythropoietin)
Doping mit Hormonen Erythropoietin - EPO Wirkung von EPO (Erythropoietin) Ekblom and Berglund (J.Intern.Med. 229, 1991, p125) maximal exercise Work time, sec to 583 VO2max , l/min 4,52 to 4,88

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46 Dopinganalytik IEF PATTERN 5.21 5.21 4.42 4.42 pH pH 3.77 3.77
Erythropoietin - Urintest EPO Urintest Lasne F, de Ceaurriz J IEF PATTERN 5.21 4.42 3.77 pH 5.21 4.42 3.77 pH BB 100% 34% 28% 95%

47 Peptidhormon Erythropoietin (EPO) Nachweis
Dopinganalytik Erythropoietin - Urintest Peptidhormon Erythropoietin (EPO) Nachweis 5.21 4.42 3.77 pH Olympische Winterspiele 2002 Salt Lake City 3 Athleten werden der Anwendung eines neuen EPO-Präparates - Darbepoetin (NESP) überführt Produktinformation der Firma Ambgen zu Darbepoetin (Aranesp®)

48 Polyethylenglycol (PEG)
Dopinganalytik Neuentwicklungen Polyethylenglycol (PEG) EPO

49 Dopinganalytik Neuentwicklungen

50 ESA – Erythropoese stimulierende Substanzen
EMP1 Ac-GGTYSCHFGPLT W VCKPQGG-Am BB68 Ac-GGTYSCHFGKLT-nal-VCKKQRG-Am Dimerisierung Kovalente Bindung an Hydroxyethylstärke (HES) Hohe Affinität zum EPO-Rezeptor Hemomer AplaGen

51 Manipulation Urinproben nach Zusatz von Proteasen (Proteasen)

52 Manipulation Effekte beim Waschen durch Proteasen
Urinproben nach Zusatz von Proteasen Effekte beim Waschen durch Proteasen

53 Dopinganalytik IEF PATTERN 5.21 5.21 4.42 4.42 pH pH 3.77 3.77
Erythropoietin - Urintest EPO Urintest Lasne F, de Ceaurriz J IEF PATTERN 5.21 4.42 3.77 pH 5.21 4.42 3.77 pH Urinproben Standard

54 Manipulation IEF PATTERN 5.21 5.21 4.42 4.42 pH pH 3.77 3.77
direkter Nachweis der Proteasen Manipulation Urinproben nach Zusatz von Proteasen IEF PATTERN 5.21 4.42 3.77 pH 5.21 4.42 3.77 pH Urinproben Standard

55 Dopingliste der WADA Verbotene Substanzen und Methoden S4. Hormon Antagonisten und Modulatoren 1. Aromatase-Inhibitoren z.B. Anastrozol, Letrozol, Aminoglutethimid, Exemestan, Formestan, Testolacton 2. Selektive Estrogen-Rezeptor Modulatoren (SERMs): z.B. Raloxifen, Tamoxifen, Toremifen 3. Andere anti-estrogene Substanzen z.B. Clomiphen, Cyclofenil, Fulvestrant 4. Myostatin Inhibitoren

56 Myostatin - Myostatingen
Dopingliste der WADA Myostatin - Myostatingen Myostatin ist ein Wachstumsfaktor und bei der Regulation des Muskelwachstums von Bedeutung. Hierbei übernimmt es eine Art der negativen Regulation. Wird die Myostatinbildung gehemmt bzw. fällt sie ganz aus, so kommt es zu einem vermehrten Muskelwachstum ( Abb.1 u. 2). Die Bildung des Myostatin wird über das sogenannte Myostatingen reguliert. Eine Beeinflussung dieses Gens hat somit Folgen für das Muskelwachstum. Substanzen, die die Aktivität des Myostatingens (Genexpression) hemmen, bewirken somit indirekt ein übernatürliches Muskelwachstum, was sicherlich auch zu Dopingzwecken missbraucht werden kann. Abb.1 Ausfall des Myostatin-Gens bei einem "Belgian Blue"-Rind führt zu massivem Muskelwachstum     Abb.2 "Knock-out" Supermaus. (Mächtig hypertrophierte Beinmuskulatur nach Ausfall des Myostatin-Gens im Bild rechts). MYO-029 (Antikörper gegen Myostatin) Phase I/II - Verträglichkeitsstudie bei Patienten mit Muskeldystrophie

57 Doping Verbotenen Methoden M1. Methoden zur Verbesserung der Sauerstoffversorgung Präparate: Hemopure Oxyglobin crosslinked quervernetzt polymerisiert

58 Verbotenen Methoden M3. Gendoping
Die nichttherapeutische Anwendung von Zellen, genetischen Elementen oder die Beeinflussung der Genexpression mit dem Ziel der sportlichen Leistungssteigerung ist verboten. Gentherapeutische Verfahren Beeinflussung der Genexpression

59 Gendoping Ropoxygen Entwicklung im Tierversuch bei Mäusen Firma
Oxford BioMedica 2002 Sauerstoffsensitiver Faktor Sauerstoffdruck über Normwerte Deaktivierung des EPO-Gens Verbesserte Sauerstoffversorgung

60 Gendoping - Nachweis

61 Gendoping - AICAR Die WADA verbietet ab den die Anwendung von AICAR und GW501516 Was ist AICAR bzw. GW1516? Was bewirkt AICAR bzw. GW1516? Kann AICAR bzw. GW1516 nachgewiesen werden ?

62 Gendoping – AICAR und GW1516
Was ist AICAR bzw. GW1516 ? C9H14N4O5 MG 258 C21H18F3NO3S2 MG 453

63 Gendoping - AICAR Wie wirkt AICAR bzw. GW1516 ?
AICAR zeigte in Versuchen bei Mäusen, dass die Laufleistung um bis zu 44 % gesteigert werden konnte. AICAR soll dabei positiv auf Gene wirken (Genexpression) und zu einer vermehrten Bildung von Enzyme für die oxidative Energiebereitstellung führen, insbesondere soll die Substanz so positiv auf die Fettverbrennung wirken. Medizinisch wäre dieses von Bedeutung für eine medikamentäse Behandlung von Übergewicht (z.B. bei Adipositas). . Keine Daten beim Menschen ! .

64 Gendoping - AICAR Kann AICAR bzw. GW1516 nachgewiesen werden ?
Der Nachweis ist problemlos im Urin möglich ! Technik : LC/MS/MS AICAR kommt aber auch natürlich vor und wird in den Urin ausgeschieden, GW1516 ist „absolut körperfremd“