Wir erinnern uns….

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1 Wir erinnern uns…

2 Nennt Informationen, die ein Wissenschaftler für die Durchführung des farbig markierten Schrittes benötigt. Nennt zusätzliche Probleme die bei der Verwendung eines Gens aus einer menschlichen Zelle (nicht wie hier dargestellt aus einem Bakterienplasmid) existieren.

3 Durchschnittliche Genlänge Dystrophin-Gen (längstes menschliches Gen)
Problem: Die Suche nach einem einzelnen Gen in einem riesigen Genom (oder: Die goldene Nadel im Heuhaufen) Zur Verdeutlichung: Wie lang ist ein Gen im Vergleich zur gesamt-DNA eines Menschen? Ein durchschnittliches Gen entsprich etwa 0,0001% des gesamten menschlichen Genoms! Um ein einzelnes Gen sauber aus der DNA einer eukaryotischen Zelle ausschneiden zu können müssten wir den genauen Genlocus kennen UND in der Nähe liegende Schnittstellen für Restriktionsenzyme identifizieren Weiteres Problem: meist ist nur die ungefähre Basensequenz des Gens bekannt, selbst wenn man die Aminosäuresequenz des entstehenden Proteins genau kennt! (Warum?) Durchschnittliche Genlänge Dystrophin-Gen (längstes menschliches Gen) Gesamt-Genom 1000 – Basen 2,5 * 106 Basen (mit Introns) 3,27 * 109 Basen

4 Die Lösung des Problems
Wir schneiden das gesamte Genom in kleine Stücke, gucken uns jedes Stück an und suchen uns dann das richtige Stück heraus! Motto: Wenn genau zu lange dauert, machen wir es eben ungenau und schnell! Name der Methode: Shotgun-Klonierung (bei einem Streuschuss wird schon irgendeine Kugel treffen) Schlage eine Methode vor um das Genom in kleine Stücke zu zerlegen Die Einzelstücke müssen zur sinnvollen Untersuchung vervielfacht werden. Schlage eine bereits bekannte Methode vor um in kurzer Zeit viele Kopien der kurzen DNA-Abschnitte herzustellen.

5 Die Vorgehensweise 2. Vervielfältigung der DNA in Bakterien durch Plasmidvektoren 3. Untersuchung der entstandenen Bakterienkolonien (?!) 1. Zerschneiden des Genoms mithilfe von Restriktionsenzymen

6 Heftaufschrieb 5.3 Isolierung einzelner Gene
Will man für die Gentechnik einzelne Gene aus einer Zelle extrahieren hat man häufig das Problem, dass weder der genaue Genlocus, noch die exakte Sequenz, noch Schnittstellen für Restriktionsenzyme in der Umgebung bekannt sind. Die häufigste Methode zur Isolierung einzelner Gene ist die sogenannte Shotgun-Klonierung, die in mehreren Schritten abläuft: Mithilfe von Restriktionsenzymen werden zahlreiche Kopien eines kompletten Genoms in kleine Fragmente zerlegt Alle entstandenen Fragmente werden mithilfe von Plasmidvektoren in Bakterienzellen eingeschleust und diese werden getrennt durch Zellteilung vermehrt (kloniert) Unter diesen Kolonien wird mithilfe von Gensonden (-> AB) diejenige herausgesucht, bei der das gesuchte Gen im Plasmid eingebaut ist Die gesamte Sammlung von Bakterienkolonien mit verschiedensten DNA-Abschnitten die in Schritt 2 entsteht wird als Gen-Bibliothek bezeichnet.

7 Bitte Arbeitsblatt 5.3 bearbeiten

8 Lösungsvorschläge Die Wechselwirkung bei der Hybridisierung. Warum haben exakt komplementäre Stränge eine stärkere Wechselwirkung? Die DNA-Basen gegenüberliegender DNA- oder RNA-Stränge bilden untereinander Wasserstoffbrücken aus. Aufgrund der Molekülstruktur können die Wasserstoffbrücken nur zwischen den komplementären DNA-Basen entstehen. Je mehr komplementäre Basen sich also gegenüberstehen, desto stärker die Wechselwirkung. Ungenauigkeiten bei der Basensequenz aus dem Protein Für fast jede Aminosäure besitzt der DNA-Code mehr als ein Basentriplett (siehe Codesonne, man spricht von einem degenerierten Code). Da man nicht weiß welches Triplett im Gen für welche Aminosäure herangezogen wurde erhält man meist nicht die exakte Basensequenz. Warum werden für den Einsatz von Gensonden Stempelabbilder verwendet? Das Ziel ist es ja die Kolonien, welche das gesuchte Gen enthalten, für die Gentechnik weiterzuverwenden. Allerdings muss zur Markierung die DNA in Einzelstränge aufgelöst werden und ist danach nicht mehr verwendbar. Gerade auch weil die radioaktiven Gensonden am gesuchten Gen haften!

9 Die elegante Methode: cDNA
Eine elegante Methode die Basensequenz eines gesuchten Gens zu rekonstruieren besteht in der Untersuchung der zugehörigen mRNA Das Enzym Reverse Transkriptase besitzt die Eigenschaft Einzelstrang-RNA-Moleküle in Doppelstrang-DNA (cDNA = complementary DNA) zu übersetzen (vorzufinden bei RNA-Viren deren Genom aus einem RNA-Molekül besteht) Nach dem Anfügen von sticky ends kann diese DNA in einen Plasmid- oder Virenvektor (siehe Bild) eingefügt werden

10 Aufgaben Benutzt euer Buch (S. 117) zur Hilfe um folgende Aufgaben zu bearbeiten Nennt in euren eigenen Worten mindestens zwei signifikante Vorteile der cDNA-Methode gegenüber der Shotgun-Klonierung. Nennt auch einen Nachteil. Übertragt den unten stehenden Lückentext in euer Heft und ergänzt die fehlenden Begriffe bzw. wählt die richtigen Wörter aus Eine Alternative zur Shotgun-Klonierung stellt die cDNA-Methode (cDNA = __________________) dar. Bei diesem Verfahren wird die gesuchte DNA nicht direkt aus dem ____________ des entsprechenden Organismus ausgeschnitten, sondern mithilfe des Enzyms _______________ _________________ aus einer ________-Vorlage hergestellt. Wird die Vorlage innerhalb/außerhalb des Zellkerns aus einer Zelle isoliert ist das __________________ abgeschlossen, die nicht-codierenden Abschnitte (__________) der Vorlage wurden also entfernt. Die Nucleotidsequenz entspricht also der tatsächlichen Aminosäuresequenz des gesuchten Proteins. Das einzelsträngige/doppelsträngige _______-Molekül der Vorlage wird vom Enzym in ein einzelsträngiges/doppelsträngiges _______-Molekül übersetzt. Dieses kann, nach dem Anfügen von sticky ends mihilfe des Enzyms ______________ in ___________ (Plasmide oder Viren) eingebaut werden.

11 Lösungsvorschläge Vorteile der cDNA-Methode:
Verwendet man eukaryotische Gene, so sind bei der Shotgun-Klonierung die Introns noch in der verwendeten DNA enthalten, sie gehören aber nicht zur Aminosäuresequenz des gesuchten Proteins. Diese würden von Bakterienzellen mit-translatiert werden da Bakterien-DNA keine Introns enthält. Bei der cDNA-Methode wird die mRNA, die tatsächlich nur die proteinrelevanten Basen enthält, verwendet da durch das Spleißen in der RNA-Prozessierung im Zellkern die Introns entfernt wurden. Das Ergebnis sind kürzere DNA-Abschnitte (weniger nicht-codierende Basen), da bei der Shotgun-Klonierung die Schnittstellen des Restriktionsenzyms recht weit von der codierenden Region des Gens liegen können. Nachteile: Man muss Zellen identifizieren, in denen die gesuchte mRNA tatsächlich vorliegt und diese isolieren Die mithilfe der Reversen Transkriptase erstellte cDNA liegt zunächst nur in sehr kleiner Menge vor

12 Lösungsvorschläge Eine Alternative zur Shotgun-Klonierung stellt die cDNA-Methode (cDNA = complementary DNA) dar. Bei diesem Verfahren wird die gesuchte DNA nicht direkt aus dem Genom des entsprechenden Organismus ausgeschnitten, sondern mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase aus einer mRNA-Vorlage hergestellt. Wird die Vorlage innerhalb/außerhalb des Zellkerns aus einer Zelle isoliert ist das Spleißen abgeschlossen, die nicht-codierenden Abschnitte (Introns) der Vorlage wurden also entfernt. Die Nucleotidsequenz entspricht also der tatsächlichen Aminosäuresequenz des gesuchten Proteins. Das einzelsträngige/doppelsträngige RNA-Molekül der Vorlage wird vom Enzym in ein einzelsträngiges/doppelsträngiges DNA-Molekül übersetzt. Dieses kann, nach dem Anfügen von sticky ends mihilfe des Enzyms Ligase in Vektoren (Plasmide oder Viren) eingebaut werden.

13 Was ist das?

14 Warum „genetischer Fingerabdruck“?
Jede dieser (angefärbten) Banden stellt ein charakteristisches DNA-Fragment aus dem menschlichen Genom dar Welche der Fragmente im Genom eines Individuums enthalten sind und welche nicht ist für jeden Menschen einzigartig! (wie es dazu kommt gleich!) Trennt man also eine große Anzahl aller Fragmente eines Menschen auf und stellt sie wie oben dar ergibt sich ein einzigartiges Bandenmuster, daher der Begriff „genetischer Fingerabdruck“

15 Bitte während des Films Arbeitsblatt 5.4 (Film) bearbeiten!

16 Lösungsvorschläge Worin unterscheiden sich die DNA-Abschnitte die für den genetischen Fingerabdruck herangezogen werden? Nenne die Gemeinsamkeit der Abschnitte. Die Abschnitte unterscheiden sich in ihrer Länge. Gemeinsam haben alle, dass es sich nicht um DNA-Bereiche handelt, die für Merkmale (Proteine) zuständig sind. Also keine Gene (sog. nicht-codierende Bereiche). Ergänze die Informationen zur Vervielfältigung von DNA im Labor (Polymerase-Kettenraktion, PCR) Welche Stoffe werden direkt zu der DNA-Probe gegeben? Die DNA-Bausteine: Zucker (Desoxyribose), Phosphat(ionen) und die vier DNA-Basen Welche Stoffe sind im „Reaktionsmix“ enthalten? Primer und Polymerase (genauer Taq-Polymerase) Die Schritte der Polymerase-Kettenreaktion Temperatur: 95°C Vorgang: Auftrennung der Doppelstrang-DNA in zwei Einzelstränge Temperatur: 65°C Vorgang: Primer docken an die Einzelstränge an Temperatur: 72°C Vorgang: Ausgehend von den Primern werden die Einzelstränge zu neuen Doppelsträngen ergänzt Nenne das Kriterium, nach dem die vervielfältigten DNA-Abschnitte schließlich aufgeteilt werden. Der Länge nach. Wie oben beschrieben ist das der entscheidende Unterschied zwischen den DNA-Abschnitten.

17 Einzigartige DNA-Fragmente?!
Alle Menschen haben etwa 99,9 % des Erbguts gemeinsam! Darunter zählen vor allem die meisten Gene, da sie für lebenswichtige Funktionen zuständig sind. Glücklicherweise unterscheiden sich Regionen des Genoms, die nicht für Proteine codieren (die eben nicht lebenswichtig sind) teilweise sehr deutlich voneinander. Ein typischer Fall nicht-codierender Regionen sind die sogenannten „short tandem repeats“ (STR): kurze Basenabfolgen, die vielfach wiederholt werden

18 Und wie unterscheiden sich jetzt diese STRs?!
Das Auftreten und die jeweilige Länge einer STR-Region im Genom unterscheidet sich von Mensch zu Mensch Interessant ist, das die STRs natürlich mit den Chromosomen weitergegeben, also nach den Mendel‘schen Regeln vererbt werden! Daher erlaubt der Vergleich des genetischen Fingerabdrucks auch Rückschlüsse auf Verwandtschaftsverhältnisse (Vaterschaftstest!) Untersucht man 5-10 festgelegte STR-Regionen ist die Wahrscheinlichkeit eines identischen Musters so gering, dass die gesamte Erdbevölkerung eindeutig identifiziert werden kann! (Ausnahme: eineiige Zwillinge)

19 Die Schritte zum genetischen Fingerabdruck
Auswahl der zu untersuchenden STRs Isolieren und Vervielfältigen der STRs (-> PCR) Auftrennen der STRs jeder Probe nach Länge

20 Bitte Arbeitsblatt 5.4 (Vorderseite) bearbeiten
Zusatzaufgaben (bitte mit Aufgabenstellung ins Heft): Bei der PCR wird nicht die übliche DNA-Polymerase tierischer Zellen verwendet, sondern die DNA-Polymerase der Bakterienart Thermus aquaticus (die sogenannte Taq-Polymerase). Diese lebt in extrem heißen Geysiren (beispielsweise im Yellowstone Nationalpark) und ist dementsprechend an ihre Umgebung angepasst. Begründe die Verwendung der Taq-Polymerase bei der PCR. Bei der PCR wird fast nie die komplette DNA-Vorlage vervielfältigt, sondern nur ein bestimmter Abschnitt. Hierbei ist die Auswahl der richtigen Primer verantwortlich. Erkläre in eigenen Worten, wie die richtige Primerauswahl dafür sorgt, dass ab der dritten Wiederholung nur noch Kopien des gewünschten Genabschnitts hergestellt werden! Du kannst für deine Lösung auch eine Skizze anfertigen

21 Lösungsvorschläge

22 Lösungsvorschläge Verwendung der Taq-Polymerase
Die meisten Proteine des Menschen denaturieren ab 42°C (daher die Gefahr durch hohes Fieber), wodurch insbesondere Enzyme ihre Funktion verlieren. Bei den Arbeitstemperaturen der PCR wäre es also nicht möglich eine normale DNA-Polymerase einzusetzen. Thermus aquaticus ist insofern an seine Umgebung angepasst, als das seine Proteine extrem hitzeresistent sind und die Taq-Polymerase die Arbeitstemperaturen der PCR ertragen kann. Ihre ideale Arbeitstemperatur beträgt 72°C (die durchschnittliche Temperatur eines Geysirs).

23 Lösungsvorschläge Auswahl der replizierten Abschnitte durch Primer
Die bei der PCR eingesetzen Primer stellen die Startpunkte der Replikation dar. Ist die komplementäre Basensequenz zu einem Primer jedoch nicht am Ende eines DNA-Abschnitts sondern zur Mitte hin, wird der weiter hinten liegende Abschnitt (in 3‘-Richtung der Vorlage, 5‘-Richtung der Kopie) nicht repliziert. So entsteht beim ersten PCR-Zyklus von jedem ursprünglichen Einzelstrang eine Kopie deren 5‘-Ende unvollständig ist, aber ein vollständiges 3‘-Ende besitzt. Im zweiten Zyklus lagert sich an die verkürzten Stränge der jeweils andere Primer an. Dieser setzt wiederum nicht am vollständigen 3‘- Ende der Vorlage an, sondern weiter innen. Hierdurch ist der DNA-Abschnitt an beiden Enden verkürzt und wird auch zukünftig so dupliziert. An beiden Enden verkürzt!! Werden identisch repliziert

24 Bitte Arbeitsblatt 5.4 (Rückseite) bearbeiten (Rest ist Hausaufgabe bis nach den Ferien)

25 Lösungsvorschläge 5.4 Vervielfältigung von DNA: Der genetische Fingerabdruck Bei der Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks werden bestimmte Abschnitte des Genoms vervielfältigt und untersucht. Diese Abschnitte haben die Gemeinsamkeit, dass sie nicht die Information für ein Merkmal tragen (nicht-codierende Bereiche). Es handelt sich hierbei um kurze Basenabfolgen, die mehrfach wiederholt werden (sogenannte short tandem repeats, kurz STR). Da sich die STRs in jedem Menschen bezüglich ihrer Anzahl und Länge unterscheiden, ergibt die aufgetrennte Darstellung einen sogenannten „genetischen Fingerabdruck“ einer Person. Der Vergleich von 5-10 STRs reicht theoretisch schon aus, um jeden Menschen auf der Welt eindeutig zu identifizieren (Ausnahme: eineiige Zwillinge). Aufgabe: Gib für die oben dargestellten STRs geeignete Primer mit 5 Basen Länge an (links das 5‘-Ende, rechts ist das 3‘-Ende). Beachte, dass hier nur ein Strang dargestellt ist! Beispiel 1: 5‘- ATATA-3‘ und 3‘-ATATA-5‘ Beispiel 2: 5‘- TACTA-3‘ und 3‘- TGATG-3‘ Beispiel 3: 5‘- GCAGG-3‘ und 3‘- CCGTC-5‘ Beispiel 4: 5‘- TTAAC-3‘ und 3‘- AATTG-5‘

26 Lösungsvorschläge Aufgabe: In der Abbildung oben sind vergleichbare Abschnitte aus dem genetischen Fingerabdruck einer Mutter (M), ihrer Tochter (T) und drei möglicher Väter (V) wiedergegeben. Begründe, welcher Mann der leibliche Vater ist. Banden der Tochter, die nicht bei der Mutter zu finden sind, finden sich beim Vater wieder und umgekehrt. Keine Bande der Tochter taucht weder bei Mutter noch Vater auf.