Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften Haslberger, Handschur.

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1 Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften
Haslberger, Handschur

2 Übungsablauf MO: Vortrag Methoden, DNA-Extraktion u. DNA-Reinigung
DI: 1st PCR, nested PCR, Agarosegel, Vorbereitung des DGGE-Gels, DNA-Fällung MI: DGGE, Interprätation der Ergebnisse DO: Extraktion bakterieller DNA aus Blut mittels neuer Extraktionsmethode, DNA-Messung mit UV, PCR (Hanusch Spital)

3 Inhalt Culture dependent vs. Culture independent Methods PCR RT-PCR
DGGE, TGGE SSCP, MSSCP RFLP, TRFLP RISA, ARISA Cloning, Sequencing

4 2 ways for identification: +/- cultivation
Culture Culture- dependent Methods Sample DNA/RNA Culture- independent Methods Identification of Microorganisms

5 Only 1-5% of bacteria can be identified in ecosystems using methods including cultivation
Habitat Cultivability (%) Freshwater 0,25 Brackish water 0,1-3 Sedimente Soil 0,3 Food general 0,5-10

6 Culturable Wachstumsbedingungen bekannt Keim lebend
Temperatur, Nährstoffe, aerob/anaerob Keim lebend Verschiebung der Flora 99% aller Bakterien unbekannt

7 Culture independent

8 Culture independent Spezies Sequenz
S. aureus CGAA CGG ACG AGA AGC TTG CTT CTC T GAT S. epidermidis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC S. capitis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC S. warneri CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC S. haemolyticus CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC

9 Polymerase Chain Reaction

10 Realtime-PCR

11 RT-PCR Fluorescence (F1) Cycle Number 103 cop 104 cop 105 cop 106 cop
1.000 10.000 45 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Fluorescence (F1) Cycle Number 106 cop 105 cop 104 cop 103 cop

12 RT-PCR

13 Denaturant Gradient Gel Electrophoresis

14 Denaturant Gradient Gel Electrophoresis

15 Temperature Gradient Gel Electrophoresis
Prinzip wie DGGE Keine DNA- denaturierende Substanzen Temperatur Gradient

16 Singlestrand Conformatiom Polymorphism
DNA denaturierende Substanzen der Probe zugesetzt  ssDNA Unterschiedliche Konformation der ssDNA beeinflusst Laufgeschwindigkeit im Gel

17 SSCP

18 Multitemperature Singlestrand Comformation Polymorphism
ssDNA Denaturants added to PCR- product Different bands because of different conformation of ssDNA Temperature is changing during the electrophoresis Using high voltage

19 MSSCP

20 Temperatur changing during run
5´ 22°C 10°C 2´ Zeit

21 MSSCP SSCP bei untersch. Temp. SSCP m. wechselnder Temp.= MSSCP

22 MSSCP

23 (Terminal) Restriction Fragment Length Polymorphism

24 Cutting enzymes HIND III A/AGCTT BAM HI TGG/CCA Eco RI GT/AATTC
1) -AGTTGG CCAAGCTTTGCTTAGGC 2) -AGGTCCTGATGA AGCTTGGTTAT 3 ) -TTTGG CCATTA AGCTT AGT AATTC 1) 2) 3) 1) + 2) + 3)

25 (Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis
dsDNA between 16 S and 23 S rRNA-Gene (Intergenic Spacer) Fluorescently primers Different bands because of different length of PCR- product

26 Sensitivity DGGE: 95 - 100% 100-700 bp SSCP: 80 - 85 % 100-500 bp
MSSCP: % bp [T]RFLP: 90 – 100% bp [A]RISA: % bp

27 Membran Hybridisierungsverfahren
Target DNA Northern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird RNA nachgewiesen Southern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird DNA nachgewiesen Y Western Blot: Mit markiertem Antibody wird Protein nachgewiesen

28 Monitoring Community fingerprints Identification of microorganisms
Methode Monitoring Community fingerprints Food samples Comparison of bandpatterns DNA extraction PCR DGGE Screenig for different clones and sequencing Identification of microorganisms Clone libraries

29 PCR Klonierung DGGE Amplifikation der 16S rDNA
600 –1300 bp 1. Runde PCR (lange Fragmente) Klonierung 200 – 500 bp Nested PCR Einer der Primer trägt am 5‘-Ende eine GC-clamp. DGGE

30 Agarosegel

31 DGGE

32 Cloning Extrahierte DNA ~ 700 bp PCR Amplifikation der
langen Fragmente Ligation BHI-Agar + Tet + Amp + IPTG + X-Gal

33 Cloning Lactose --> Galactose + Glc
X-Gal --> blau (Kolonien blau) Lac Z ß-Galactosidase Lactose X-Gal (Kolonien weiß) klonierte DNA

34 Blue/white screening

35 Clone screening

36 Sequenzierung

37 Sequenzierung

38 FASTA run 98% Similarity Speziesgrenze 96% Similarity Genusgrenze
Alignment DB:ID Source Length Identity% Ungapped% EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e-57 EM_PRO:AB Streptococcus epidermidis g e-48 31 98% Similarity Speziesgrenze 96% Similarity Genusgrenze

39 Tendogramm Clone

40 Fragestellung Verursachen alle (kultivierbare/nicht-kultivierbare) MOs im Blut klinische Probleme? Welche nicht-kultivierbaren MOs sind im Blut neutropenischer/septitischer Patienten? Woher kommen diese MOs/Wie gelangen sie ins Blut des Patienten? Was kann man dagegen tun? KLINISCHE BEDEUTUNG

41 Wozu molekulare Analyse ?
Blutkultur oft negativ Gewisse Menge an Keimen muss vorhanden sein Keime müssen kultivierbar sein Zeit Probenmenge 99% der Bakterien weltweit sind unbekannt NUR 1% ALLER BEKANNTEN BAKTERIEN WACHSEN UNTER LABORBEDINGUNGEN

42 Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut
Gelelektrophorese

43 Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut
Gelelektrophorese Enterobacteriaceae/Pseudomonadaceae specific Primers Staphylococcus specific Primers

44 Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut
DGGE

45 Lokalisierung der Bakterien im Blut: Fluorescents Insitu Hybridisation
unspiked spiked m. E.coli u. S.flexneri E.coli- Sonde Shigella- Sonde

46 Spezielle DNA- Extraktionsmethode
Selektive Lyse der Blutzellen Verdau der Blut- DNA Inaktivierung der DNase Lyse der Bakterienzellen Reinigung der bakteriellen DNA Extraction Protocol in cooperation with Fa. MOLZYM

47 Spezielle DNA- Extraktionsmethode
Gelelektrophorese

48 Spezielle DNA- Extraktionsmethode

49 Spezielle DNA- Extraktionsmethode
DGGE

50 Abwesenheit v. Blut-DNA

51 Sensitivität