Nicht-invasive pränatale RHD-Bestimmung RHD-Genotypisierung zellfreier fetaler DNA 32. Informationsgespräch der Blutspendezentrale für Wien,

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1 Nicht-invasive pränatale RHD-Bestimmung RHD-Genotypisierung zellfreier fetaler DNA Informationsgespräch der Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

2 Gliederung Nicht-invasive fetale RHD-Genotypisierung
1 Hintergrund Prävention der Anti-D Bildung in der Schwangerschaft, Management von Antikörperträgerinnen in der Schwangerschaft Standard-Prozedere und fetale Genotypisierung im Vergleich Grundlagen der nicht-invasiven fetalen Gen-Diagnostik Zuverlässigkeit der Methode: Sensitivität und Spezifität 2 3 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

3 Nutzen fetaler RHD-Bestimmung Wann interessiert der kindliche RhD-Faktor?
1 Bei RhD-negativen Schwangeren: Prävention der Anti-D-Immunisierung Kein Immunisierungsrisiko bei RHD-negativen Feten Bei Antikörperträgerinnen: Nachweis des fetalen RHD-Genotyps HDFN-Risiko nur bei RHD-positiven Feten Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

4 Prävention der Anti-D-Immunisierung Standards bei Schwangerschaften RhD-negativer Frauen1
- 28. SSW: Anti-D Immunglobulin - Bei RhD-positiven Neugeborenen: Anti-D Immunglobulin < 72 h p. partum 1 KAV-Richtlinien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

5 Anti-D-immunisierte Schwangere Voraussage für die Entwicklung einer HDFN
1 nicht invasive Diagnostik (Mutter): Anti-D-Titerbestimmung Ultraschall fetales RHD-Screening (RHD-NIPD) Invasive fetale Diagnostik: Diagnostik beim Kindesvater (?) Amniozentese RhD und Choriozentese RHD-Zygotiebestimmung Cordozentese (PCR) Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

6 Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung
1 Prof. J. Deutinger Universitätsklinik für Frauenheilkunde Medizinische Universität Wien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

7 Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung
1 Prof. J. Deutinger Universitätsklinik für Frauenheilkunde Medizinische Universität Wien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

8 Hydrops fetalis, 11. – 14. SSW 1 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

9 Doppler Ultraschalldiagnostik
A. cerebri media flow (MCA-PSV) Doppler Ultraschalldiagnostik Flow velocity waveform in the fetal middle cerebral artery in a severely anemic fetus at 22 weeks (left) and in a normal fetus (right). In fetal anemia, blood velocity is increased Bei einer schweren fetalen Anämie (Hb <6g/dl) ist die Flussgeschwindigkeit in der A. cerebri media signifikant erhöht. Scheier M, Prediction of severe fetal anemia in red blood cell alloimmunization after previous intrauterine transfusions. Am J Obstet Gynecol Dec;195(6): Epub 2006 Jun 21 Collins CY, Evaluating suspected fetal anemia with Doppler ultrasound. J Reprod Med Jun;50(6):379-82

10 Anti-D-immunisierte Schwangere Voraussage für die Entwicklung einer HDFN
1 Nicht-invasive Diagnostik (Mutter): Anti-D-Titerbestimmung Ultraschall fetales RHD-Screening (RHD-NIPD) Invasive fetale Diagnostik: Diagnostik beim Kindesvater (?) Amniozentese RhD und ggf. Choriozentese RHD-Zygotiebestimmung Cordozentese (PCR)

11 Nutzen fetaler RHD-Bestimmung (Wann) ist die Genotypisierung sinnvoll?
Prävention der Anti-D-Immunisierung bei Schwangerschaft RhD-negativer Frauen Bei Antikörperträgerinnen: Nachweis des fetalen RHD-Genotyps 2 Vermeidung von: passiver Immunprophylaxe (humanes Plasmapräparat) Unabhängigkeit von der Verfügbar-keit von humanem Anti-D Kosteneffizienz? Frühzeitige Klarheit Vermeidung von: invasiver Diagnostik und assoziierter Risiken

12 Entwicklung der RHD-NIPD Internationale Arbeitsgruppen
SAFE NoE - Gruppe Special Non-Invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network of Excellence Sixth EC Framework Program Gemeinsame Protokolle Multizentrische Evaluierung Standardisierung der Prozesse 2

13 Grundlage der Genotypisierung RHD- und RHCE-Gen
3 Daniels G. Human Blood Groups RHD negativ RHD positiv (heterozygot) RHD positiv (homozygot)

14 Fetale Genotypisierung aus maternalem Plasma Lo et al
Fetale Genotypisierung aus maternalem Plasma Lo et al. weisen DNA männlicher Feten in maternalem Plasma nach LO, Y.M.D. et al Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 350: 485–487. FINDINGS: Fetus-derived Y sequences were detected in 24 (80%) of the 30 maternal plasma samples, [...] None of the 13 women bearing female fetuses, and none of the ten non-pregnant control women, had positive results for plasma, serum or nucleated blood cells. INTERPRETATION: Our finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have implications for non-invasive prenatal diagnosis, and for improving our understanding of the fetomaternal relationship. 3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

15 Zellfreie fetale DNA Synzytiothrophoblast als Ursprung der fetalen DNA
3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Kumpel et al. Transfusion 2008

16 Zellfreie fetale DNA Synzytiothrophoblast als Ursprung der fetalen DNA
3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Kumpel et al. Transfusion 2008

17 Anteil fetaler DNA an der zellfreien mütterlichen DNA Die cffDNA-Menge ist abhängig vom Gestationsalter des Feten Die DNA-Menge liegt zum Zeitpunkt der Untersuchung teilweise nahe dem stochastischen Bereich der rqPCR. DNA-Qualität: die cffDNA ist stark fragmentiert 3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

18 Fetale Genotypisierung aus maternalem Plasma Quantitativer Anteil an maternaler cfDNA nach Gestationsalter Lo YM, Tein MS, Lau TK, Haines CJ, Leung TN, Poon PM, Wainscoat JS, Johnson PJ, Chang AM, Hjelm NM. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet Apr;62(4): ~25.4 genome equivalents/ml (range ) in early pregnancy 3.4% (range 0.39%-11.9%) of the total plasma DNA ~292.2 genome equivalents/ml (range ) in late pregnancy 6.2% (range 2.33%-11.4%) of the total plasma DNA 3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

19 Konzentration der cffDNA Konzentrationsunterschiede bei gleichem Gestationsalter
3 C. Ellen van der Schoot Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

20 Studien zur RHD-NIPD Review
4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

21 Studien zur RHD NIPD Ergebnisse von Sanquin, NL
4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

22 Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNA Beispiele
Y-chromosomale Marker Lo et al SYR Chin and Lo SYR Rijnders et al SYR Avent and Chitty SYR Genetische Polymorphismen Lee et al HLA-DQ Legler et al RHCE, C, E, c Van der Schoot et al insertion/deletion Brojer et al insertion/deletion Epigenetik Chan et al RAASF1A 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

23 Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNA Sensitivität der Methoden
Zuverlässigkeit der Methode ist abhängig von: - geeignete Amplifikationskontrollen für fetale DNA - geeignetes Entscheidungsschema Das Verfahren muss ausreichend sensitiv sein, jeden RHD-positiven Feten richtig zu typisieren. Falls zu wenig fetale DNA vorhanden ist, muss das erkannt werden. 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

24 Amplifikation fetaler DNA Spezifität der Methoden
Falsch positive Ergebnisse sind nicht kritisch: Bei vermeintlich RHD-positiven Feten würde der Schwangeren eine nicht indizierte Anti-D-Prophylaxe verabreicht werden. 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

25 Fetale DNA-Methylierung Universaler fetaler DNA-Marker für nicht-invasive Diagnostik
K.C. Allen Chan et al. Hypermethylated RASSF1A in Maternal Plasma: A Universal Fetal DNA Marker that Improves the Reliability of Noninvasive Prenatal Diagnosis Clinical Chemistry 2006;52(12): BstU I methylation-sensitive restriction enzyme CG’CG, GC’GC 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

26 DNA-Methylierung in vivo-Bedeutung der DNA-Methylierung
Eukaryonten Epigenetik - Genexpression Hypermethylierung führt zur Suppression der GenExp. Prokaryonten Schutz vor DNA anderer Organismen Methylierung blockiert Enzym-Schnittstelle eigener DNA - fremde (Bakteriophagen-) DNA wird zerstört 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

27 DNA-Methylierung in vitro-Bedeutung für die fetale Diagnostik
Enzymatische Verdauung der mütterlichen Plasma-DNA fetale Methylierung blockiert die Restriktionsschnittstelle  die methylierte fetale Gensequenz bleibt erhalten  die maternale Sequenz wird zerstört Die Menge der fetalen DNA kann gemessen werden 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

28 Amplifikationskontrolle für fetale DNA methyliertes fetales RAASF1A
Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNA Abb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

29 RHD-NIPD SAFE-Protokoll
Abb.3: RHD negativer männlicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

30 RHD-NIPD SAFE-Protokoll
Abb.5: RHD positiver weiblicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

31 Amplifikationskontrolle für fetale DNA methyliertes fetales RAASF1A
Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNA Abb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

32 4 Entscheidungsbaum bei Verwendung von RASSF1A und ACTB für das Prä-
natale RHD-Screening nach Chan et al. Clinical Chemistry 2006;52(12): 4

33 Zusammenfassung Nicht-ivasive pränatale RHD-Diagnostik bei Antikörperträgerinnen
Frühzeitiger Ausschluss RHD-negativer Feten Vermeidung invasiver Diagnostik Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

34 Zusammenfassung NIPD: Kriterium zur Indikationsstellung der Anti-D-Prophylaxe
Hohe Sicherheit gegenüber falsch positiven Ergebnissen Vermeidung unnötiger Anwendung von humanem Anti-D Unabhängigkeit von der Verfügbarkeit von Anti-D 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

35 RHD-NIPD Arbeitsgruppe
Elisabeth Schwartz-Jungl1 Dieter Schwartz1 Claudia Hobel2 Christof Jungbauer2 Josef Deutinger3 Peter W. Husslein3 W. R. Mayr1,2 1 Universitätsklinik für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin, Medizinische Universität Wien 2 Österreichisches Rotes Kreuz, Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland 3 Universitätsklinik für Frauenheilkunde, Medizinische Universität Wien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

36 www.blut.at www.roteskreuz.at www.blut.at www.roteskreuz.at
Österreichisches Rotes Kreuz Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland